THESE L UNIVERSITÉ BORDEAUX I & UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE - PDF

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n ordre 3151 THESE PRESENTEE A L UNIVERSITÉ BORDEAUX I & UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE ECOLE DOCTORALE SCIENCES DE LA VIE, GÉOSCIENCES, SCIENCES DE L ENVIRONNEMENT Par Federico VALORI pour obtenir le grade de DOCTEUR Spécialité: Biogéochimie de l Environnement Dottore di ricerca in Scienza del Suolo e Climatologia Effects of root exudates on cadmium bioavailability in the rhizosphere. Assessment of cadmium toxicity to plants and microorganisms, and soil remediation Directeurs de Recherche: Pr. L. Landi & Dr. M. Mench Soutenue le 11 avril 2006 Après avis de: M. J. VANGRONSVELD (Professeur, Université de Hasselt, Belgique) Rapporteur M. C. ROBIN (Chargé de Recherche, HdR, INRA, Nancy, France) Rapporteur Devant la commission d examen formée de : Mme L. LANDI (Professeur, Université de Florence, Italie) Président M. S. GREGO (Professeur, Université de Tuscia di Viterbo, Italie) Examinateurs M. M. MENCH (Directeur de Recherches, HdR, INRA/Université de Bordeaux 1, France) M. R. MICHALET (Professeur, Université de Bordeaux 1, France) 2 ACKNOWLEDGMENTS I am grateful to Prof. Richard Michalet and the whole Community Ecology Group at the UMR BIOGECO INRA 1202 of the University of Bordeaux 1 for their hospitality during my experience in France. To Estelle, Emmanuel, Sylvain, and Blaise go my particular thanks for their patience in dealing with my moods each day. Dr. Michel Mench was an excellent teacher and tutor, and to him goes all my appreciation for having been a master of life, both during my visit in Bordeaux and, despite the distance, later. Thank you, Michel. I am grateful to Prof. Ludo Diels, Karolien.Vanbroekhoven and Albert.Bossus at the VITO (Flemish Institute for Technological Research) Mol, Belgium for their hospitality. The research was financially supported by the French-Italian VINCI project. Volevo anche ringraziare i miei tutori in Italia, la Professoressa Loretta Landi ed il Professor Paolo Nannipieri, per avermi sempre seguito e consigliato. Un grazie anche al Dott. Giancarlo Renella per i suoi continui suggerimenti e stimoli professionali. A tutto il Dipartimento di Scienze del Suolo e Nutrizione della Pianta prima di tutto devo le mie scuse per aver stressato tutti in questi ultimi mesi con le mie paturnie da tesi di dottorato. A Luca Calamai e Ottorino Luca Pantani un grazie per aver sempre creduto a scatola chiusa nelle mie capacità e per tutti i consigli. Un grazie a Judith per il suo incondizionato sostegno morale di questi anni. A Maria Teresa, Giacomo Certini, Giacomo Pietramellara, a Paola, Irene, Samuele, Tommaso e Laura; alle nuove entrate, a cui cedo volentieri il testimone, Caterina e Giulia; a Paola Ricci che ha impedito che mi chiudessero il conto in banca mentre ero all estero, a Fabrizio, insomma non voglio dimenticare nessuno e abbraccio tutti. Grazie di cuore. A mia madre e mio padre un profondo grazie per continuare a sostenermi in tutto e per tutto e per essere sempre stati, anche nei periodi peggiori che abbiamo attraversato, un caldo rifugio dove tornare nei momenti difficili. A mia nonna che ha lasciato un profondo ed incolmabile vuoto. A mio fratello, alla mia meravigliosa cognata Ricarda, ed ovviante ai bellissimi nipoti Leandro e Fedra. A Orlando, Mirella ed Andrea per la forza che la certezza della loro presenza mi ha sempre dato. Al resto della mia famiglia che porto sempre con me, grazie. 2 3 Vorrei ringraziare anche il Dott. Alberto e sua moglie Enrica, nonché la nonna Giselda e tutta la famiglia di Barbara per avermi accolto fra loro, e per il loro impegno a farmi sentire sempre ben accetto. Un grazie a Tommaso con la speranza di vedersi più spesso; a Pablo e Corrado che ormai sono molto di più che amici da quasi un quarto di secolo (anche questa tesi conferma che faries si fa tutto ). Al mio faro illuminante Alessandro dico che gli voglio bene ed a sua moglie Raffaella mando un bacio (F.a.P ora e sempre ). A Danilo, a Sara e al Biondo un grazie per l amicizia. A Tino, Chino Opolino e Cocco grazie per il calore. 3 4 Barbara, oggi sei già il mondo, domani sarai anche la mia famiglia. Ci aspettano momenti duri e momenti in cui vacilleremo ma ci saranno tanti e tanti giorni meravigliosi e indimenticabili. Come alla notte segue sempre il giorno noi percorreremo questa vita fianco a fianco, per sempre. A te che sei la mia donna, amante, amica e futura moglie voglio dedicare questo mio lavoro che per tanti versi e più di tutti, hai contribuito a realizzare. Ti amo Barbara, sempre tuo Federico. 4 5 CONTENTS:... 1 Acknowledgments... 2 Abstract... 8 Résumé Riassunto CHAPTER ONE-GENERAL INTRODUCTION The Rhizosphere A definition of bioavailability Chemistry and toxicity of cadmium in soil Physical and chemical characteristics Sources of Cadmium Mobility of Cd in the soil Technique of speciation of cadmium in soil Cadmium interactions with plants Cadmium and nutrient uptake by plants Cadmium tolerance, detoxification and accumulation by plants Toxicity of cadmium Toxicity of cadmium on plants Oxidative stress in plants Cadmium toxicity for human health Cadmium toxicity to soil microorganisms In situ remediation of metal contaminated soils Legislation Laboratory and Field experiments References CHAPTER TWO-THE AIMS OF THE THESIS CHAPTER THREE-BIOSENSOR USE TO QUANTIFY CADMIUM BIOAVAILABILITY IN THE RHIZOSPHERE Introduction The BIOMET Biosensor 6 2. Materials and methods Soils Soil treatments and incubation conditions Cadmium bioavailability Statistical analysis Results Bioavailable Cd Discussion and Conclusion References CHAPTER FOUR-INFLUENCE OF ROOT EXUDATES ON THE MOBILITY OF CADMIUM AND ON BIOCHEMICAL PARAMETERS IN THE RHIZOSPHERE AND BULK SOIL Introduction Materials and Methods Soils Experimental setup Soil respiration and ph Determination of the inorganic nitrogen Microbial Carbon and Nitrogen Biomass Cadmium availability Statistical analysis Results Soil ph Soil respiration Cumulative respiration Inorganic Nitrogen pools Cadmium availability Microbial biomass, C and N contents Discussion References 7 CHAPTER FIVE-ASSESSMENT OF CADMIUM TOXICITY TO PLANTS AND SOIL REMEDIATION THROUGH THE AIDED-PHYTOSTABILIZATION Introduction Materials and Methods Soil type and characteristics Additive properties Laboratory experiments Plant properties and greenhouse experiment Hydroponic experiment Chlorophyll and carotenoid content Guaiacol peroxidase (GuPx) activity Cadmium determination Statistical analysis Results and Discussion Plant biomass: shoots and roots yielded Cadmium availability and mineral effects ph Effect of amendment on the chlorophill content Hydroponic results Conclusion CHAPTER SIX-GENERAL DISCUSSION The thesis was prepared at: Università degli Studi di Firenze, Dipartimento di Scienze del Suolo e Nutrizione della Pianta Piazzale delle Cascine 28, 50144, Firenze, Italia. UMR BIOGECO INRA 1202, Ecologie des Communautés, Université Bordeaux 1, avenue des Facultés F-33405, Talence, France. 7 8 Abstract Effects of root exudates on cadmium bioavailability in the rhizosphere. Assessment of cadmium toxicity to plants and microorganisms, and soil remediation. Long-term Cd contaminated soils were used to assess the effects of low molecular weight root exudates, released in a model system by a filter placed on the soil surface, on microbial C and N biomass, microbial respiration, inorganic N pools, and cadmium bioavailability in the rhizosphere. Cadmium was added in field plots (AGIR experiment, Bordeaux, France) between 1988 and 1990 as Cd(NO 3 ) 2 to reach concentrations ranging from 0.7 to 38.7 mg Cd kg -1 soil d.w. in the m depth layer of sandy soils. Soils were sampled in mg C kg -1 of model root exudates (MRE) glucose, citric acid and glutamic acid were added at 0, 2, 4 and 7d. Periodically, at 0, 4, 7, and 14d, the soil was sampled from two layers, i.e. 0 2 and 6 14 mm below the filter s surface, which were indicated as rhizosphere and bulk soils, respectively. Cadmium concentration in soil did not affect the MRE mineralization, N inorganic content and microbial C biomass were not reduced. N microbial biomass showed a slightly reduction. The soil respiration increased in higher cadmium contaminated soils. Labile fraction and cadmium bioavailability were measured by single step chemical extractions and by the BIOMET bacterial biosensor system. Cadmium bioavailability was detectable only in soils contaminated with 38.7 mg Cd kg -1. The Cd bioavailability was affected mostly by citric and glutamic acids. The value of Cd-labile fraction measured with 1M NH 4 NO 3 extraction was similar in the rhizosphere and bulk soils and generally the Cd mobility was not affected by the MRE. The Cd solubility was low even in the higher contaminated soils, and this may explain the lack of negative effects of Cd on biochemical parameters. The low Cd mobility would be imputed to the buffer properties of AGIR soils. In fact no ph changes were measured, even with citric acid treatments. The results of biosensor in higher contaminated soils were in agreement with the results from chemical extraction showing low exposure to Cd and Cd uptake for bacteria. The potential use of Holcus lanatus L. as a plant species usable in aidedphytoremediation, was preliminary assess in hydroponic culture for 4w. Plants were precultivated in the AGIR soils of highest contaminated plots (38.7 mg Cd kg -1 d.w.) and control plots (0.7 mg Cd kg -1 d.w.), and then transplants were collected. 8 9 Contaminated nutrient solutions were used to mimic the extractable Cd contents and ph of original plots (ph 7 and ph 5.5, respectively). Cadmium uptake and storage was measured in shoots, leaves, and roots. Guaiacol peroxidase activity (GuPx) in leaves, total chlorophyll and carotenoid contents were quantified to monitor the effects of cadmium exposure on plants. Plants grown in control nutrient solution had the highest yields and lowest Cd concentration. The leaf GuPx activity was higher in plants grown in Cd contaminated nutrient solution in response to the oxidative stress condition induced by Cd exposure and Cd accumulation in plant tissues. Chlorophyll and carotenoid contents were clearly higher in leaves of plants cultivated in control nutrient solution. No effect of solution ph was noticed. Cadmium accumulated in plants was mostly localized in roots with a low percentage of translocation in shoots. It was therefore relevant to use H. lanatus plants in aided-phytoremediation experiments carried out both in laboratory and greenhouse conditions. Cadmium-contaminated soils were remediated according to the in situ stabilization technique using three inorganic amendments: beringite+iron grit (5+1% w/w, ph 8.0), sepiolite (6% w/w, ph 8.5), bentonite (6% w/w, ph 3.5). Mobility of cadmium was monitored in soil pore water in the first days after the soil amendment (0, 2, 4, 7, and 14d) and after 6 months using a soil moisture sampler (Rhizon MOM). Cadmium concentration in soil pore water was reduced by sepiolite (reduction ranged between 50%-98.7%) and beringite+iron grit (reduction between 30.4% and 84.6%) but bentonite, due to its low ph, initially increased the Cd availability. The effectiveness of in situ soil remediation through stabilisation was assessed in the amended soils with three different cadmium tolerant plant species (non-tolerant: Phaseolus vulgaris L., medium tolerant: Holcus lanatus, tolerant: Lactuca sativa L. var smeraldo ). Visual stress symptoms and biometrical parameters were monitored, and total chlorophyll content was measured. No visual symptoms were detected on aerial plant parts but despite soil amendment reduced the Cd availability, attention is required on the growth conditions created by the minerals that may have higher negative effects (water deficiency and soil compression) than those due to cadmium exposure. Lettuce grown in soils treated with bentonite presented low biomass independently of cadmium concentration. Based on shoot yield, H. lanatus grown on amended Cd-contaminated soils did not experience negative impacts and confirmed its potential role of plant species that can potentially be employed in aided phytostabilization. Keywords: bentonite, beringite, microbial biomass, biosensor, cadmium, selective extraction, root exudates, Holcus lanatus L., Lactuca sativa L., Phaseolus vulgaris L., 9 10 phytoremediation, sepiolite, in situ stabilization, soil remediation, rhizosphere, contaminated soil, soil pore water. 10 11 Résumé Effets des exsudats racinaires sur la biodisponibilité du cadmium dans la rhizosphère. Evaluation de la toxicité du cadmium pour les plantes et les microorganismes, et remédiation du sol. Des sols contaminés uniquement en cadmium (Cd), depuis une longue période, ont d abord été utilisés pour évaluer les effets d exsudats racinaires de faible masse moléculaire, libérés dans un système modèle par un filtre placé à la surface du sol, sur les biomasses microbiennes carbonées et azotées, la respiration microbienne, le pool inorganique d azote et la biodisponibilité de Cd dans la rhizosphère. Le cadmium a été apporté dans les parcelles (6 m X 3 m) d un essai de longue durée (essai de longue durée AGIR, Bordeaux, France), sur la période , sous forme de Cd(NO 3 ) 2 et les concentrations en Cd variaient en 2003 de 0,7 à 38,7 mg Cd kg -1 sol d.w. dans l horizon de surface (0-0.3 m) de ces sols sableux (Arenic Udifluvent). L équivalent de 200 mg C kg -1 sol sous forme d une solution modèle d exsudats racinaires (MRE), de glucose, d acide citrique ou d acide glutamique ont été apportés à la surface du sol. Périodiquement, i.e. à t = 0, 4, 7, et 14 j, le sol a été échantillonné dans deux couches de sol distantes respectivement de 0 2 mm et 6 14 mm par rapport au-dessous de la surface du filtre, correspondant de façon arbitraire à la rhizosphère et au sol distant non rhizosphérique. Les concentrations totales croissantes en Cd du sol n ont pas affecté la minéralisation des exsudats racinaires modèles (MRE), et la biomasse microbienne en C n est pas diminuée. La biomasse microbienne en N est diminuée. La respiration microbienne a augmenté dans les sols plus contaminés. La fraction labile et la biodisponibilité du Cd des sols ont été ensuite déterminées par une extraction sélective et le biosenseur bactérien BIOMET. La biodisponibilité de Cd, révélée par la bioluminescence des bactéries, n a été détectée que dans les sols contaminés contenant 38,7 mg Cd kg -1. La biodisponibilité de Cd a été modifiée essentiellement en présence des acides citrique et glutamique. La quantité de Cd dans la fraction labile extraite par une solution 1M NH 4 NO 3 1M était similaire dans les sols rhizosphériques et non-rhizosphériques. En général, la mobilité de Cd n a pas été modifiée par la présence de la solution MRE. La 11 12 solubilité de Cd était faible même dans les sols les plus contaminés, et ceci expliquerait l absence d effet négatif sur les paramètres biochimiques. La mobilité réduite du Cd serait attribuable aux propriétés tampons des sols de l essai AGIR. Aucune modification du ph du sol n a été mesurée même dans les sols des traitements à l acide citrique. Les résultats des biosenseurs dans les sols les plus contaminés en Cd ont été en accord avec ceux de l extraction sélective, indiquant à la fois une faible exposition au Cd et une faible bioaccumulation de Cd dans les bactéries. La possibilité d utiliser une espèce végétale, Holcus lanatus L., pour la phytoremédiation aidée de sols contaminés en Cd a été étudiée de façon préliminaire en solution hydroponique sur une période de 4 semaines. Les plantes ont été pré-cultivées dans les parcelles AGIR contrôles (fonds pédogéochimique 0,7 mg Cd kg -1 d.w.) et fortement contaminées (38,7 mg Cd kg -1 d.w.), puis des transplants ont été prélevés. Les plantes, dont le système racinaire a été lavé, ont été placées dans une solution nutritive simulant la concentration en Cd extrait et le ph des sols (ph 7 et 5,5, respectivement) des parcelles d origine. La concentration et la quantité de Cd ont été quantifiées dans les parties aériennes, les feuilles et les racines. On a mesuré les activités enzymatiques Guaiacol peroxidase (GuPx) dans les feuilles, ainsi que leur densité en chlorophylle et en caroténoïdes totaux afin de déterminer l effet de l exposition des plantes au Cd. Les plantes de H. lanatus cultivées sur les solutions de contrôle, non contaminées, ont donné les plus forts rendements en biomasse et les plus faibles concentrations en Cd. L activité GuPx dans les feuilles était la plus élevée dans les plantes exposées aux solutions nutritives contaminées, en réponse aux conditions de stress oxydant induites par l exposition au Cd et son accumulation dans les tissus des végétaux. Les densités de chlorophylle et de caroténoïdes totaux étaient clairement plus élevées dans les feuilles des plantes cultivées dans les solutions nutritives contrôles, non contaminées. Au même niveau d exposition en Cd, la valeur du ph de la solution n a pas eu d effet sur la réponse des végétaux. Le cadmium s est accumulé essentiellement dans les racines de H. lanatus, avec un faible pourcentage de translocation vers les parties aériennes. Il était donc probant d utiliser cette espèce végétale pour des études de phytostabilisation aidée en laboratoire et en serre. L assainissement des sols contaminés en Cd a été étudié en utilisant une technique de stabilisation in situ basée sur l apport au sol de l un des 3 composés inorganiques suivants: beringite+grenailles d acier (5+1% w/w, ph 8.0), sépiolite (6% w/w, ph 8.5), et bentonite (6% w/w, ph 3.5). La concentration en Cd a été mesurée dans la solution du sol (prélevée par bougie poreuse de type Rhizon MOM) au cours des premiers jours 12 13 suivants l amendement du sol (t = 0, 2, 4, 7, et 14 j) et après 6 mois de réaction. La concentration en Cd dans la solution du sol a été diminuée dans les traitements par la sépiolite (réduction entre 50%-98,7% selon le niveau de contamination en Cd des sols) et par la combinaison beringite+grenailles d acier (réduction entre 30,4% et 84,6%). Le traitement par la bentonite, à cause de son faible ph, a initialement augmenté la concentration en Cd dans la solution du sol. L efficacité de la remédiation des sols contaminés en Cd par stabilisation in situ a été évaluée en vase de végétation placés sous serre, avec 3 végétaux de sensibilité différente à l exposition au Cd (sensible: Phaseolus vulgaris L., moyennement tolérante: Holcus lanatus, et tolérante: Lactuca sativa L. var smeraldo ). Les symptômes visibles de stress sur les parties aériennes et les paramètres biométriques des 3 végétaux ont été déterminés. La densité de chlorophylle totale a été mesurée. Aucun symptôme visible n a été détecté sur les parties aériennes des végétaux. Bien que l amendement du sol ait diminué la concentration en Cd dans la solution du sol, une attention doit être portée sur les conditions de sol crées par les amendements. Certains d entre eux augmentent la rétention de l eau ou favorisent la compaction du sol. Ceci a eu des répercussions négatives sur la croissance des végétaux, plus importantes d ailleurs que les perturbations générées par la présence du Cd dans le sol. Il s agit en particulier de la croissance de la laitue dans les sols amendés avec la bentonite, sa croissance étant limitée quel que soit le niveau de contamination en Cd du sol. D après la biomasse de parties aériennes produites, H. lanatus, cultivée sur les sols contaminés en Cd et amendés, n indiquait pas d effet négatif. Ceci a confirmé cette espèce végétale comme un candidat possible pouvant être employé pour une remédiation de sols contamin
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