SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA - PDF

Description
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA VYUŽITIE METÓDY TECRA UNIQUE TM NA DIAGNOSTIKU SALMONEL V MÄSE A V MÄSOVÝCH VÝROBKOCH 2011 Bc. Kristína Kovárová

Please download to get full document.

View again

of 38
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Information
Category:

Memoirs

Publish on:

Views: 14 | Pages: 38

Extension: PDF | Download: 0

Share
Transcript
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA VYUŽITIE METÓDY TECRA UNIQUE TM NA DIAGNOSTIKU SALMONEL V MÄSE A V MÄSOVÝCH VÝROBKOCH 2011 Bc. Kristína Kovárová SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA VYUŽITIE METÓDY TECRA UNIQUE TM NA DIAGNOSTIKU SALMONEL V MÄSE A V MÄSOVÝCH VÝROBKOCH Diplomová práca Študijný program: Študijný odbor: Školiace pracovisko: Školiteľ: Technológia potravín Spracovanie poľnohospodárskych produktov Katedra hygieny a bezpečnosti potravín MVDr. Ľubomír Lopašovský, PhD. Nitra 2011 Bc. Kristína Kovárová Čestné vyhlásenie Podpísaná Kristína Kovárová vyhlasujem, že som diplomovú prácu na tému Využitie metódy TECRA UNIQUE TM na diagnostiku salmonel v mäse a v mäsových výrobkoch vypracovala samostatne s použitím uvedenej literatúry. Som si vedomá zákonných dôsledkov v prípade, ak hore uvedené údaje nie sú pravdivé. V Nitre Poďakovanie Týmto by som chcela poďakovať vedúcemu práce MVDr. Ľubomírovi Lopašovskému, PhD. za pomoc a odborné rady, usmernenie a podnetné pripomienky, ktoré mi poskytoval pri vypracovaní tejto práce. Zároveň ďakujem mojej rodine, ktorá ma v mojom štúdiu podporovala a povzbudzovala. Abstrakt Salmonelóza je jedným z najčastejšie sa vyskytujúcich alimentárnych ochorení u ľudí. Rýchla detekcia salmonel umožňuje predchádzať vzniku ochorení z potravín. Počas rokov 2008 a 2009 bola na prítomnosť Salmonella sp. vyšetrovaná široká škála mäsa a mäsových výrobkov, pomocou metódy TECRA UNIQUE TM (rýchla imunologická metóda). Táto metóda je rýchlou a spoľahlivou metódou na detekciu Salmonella sp. v potravinách. Zo sto testovaných vzoriek (n = 100) boli tri vyhodnotené ako pozitívne. Salmonella sp. bola detegovaná v bravčovej svalovine, tepelne neošetrenom mletom mäse a v domácej klobáse. Žiadna z tepelne opracovaných vzoriek nebola vyhodnotená ako pozitívna. Kľúčové slová: Salmonella, salmonelóza, TECRA UNIQUE, alimentárne ochorenia, detekcia baktérií. Abstract Salmonellosis is one of the most frequently reported food-borne illnesses in humans. Rapid detection of Salmonella can help prevent food-borne diseases. A wide range of meat and meat products have been examined for the presence of Salmonella sp. by means TECRA UNIQUE TM test (rapid immunoassay) during years 2008 and This Salmonella test is a method for fast and reliable detection of Salmonella sp. in food. Three of hundred tested samples (n = 100) were evaluated as positive. Salmonella sp. was detected in fresh pork muscle, heat untreated minced meat and homemade sausage. None of heat treated tested products have been evaluated as positive. Keywords: Salmonella, salmonellosis, TECRA UNIQUE, foodborne disease, detection of bacteria. Obsah Obsah... 6 Zoznam ilustrácií... 8 Zoznam tabuliek... 9 Zoznam skratiek a značiek Úvod Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí Charakteristika rodu Salmonella sp Taxonómia a nomenklatúra rodu Salmonella Antigénna štruktúra Prostredie pre rast a rozmnožovanie salmonel Primárne antropogénne salmonely Primárne zoopatogénne salmonely Salmonely v potravinách Interakcia salmonel s hostiteľským organizmom Znižovanie počtu salmonel v prvovýrobe Epidemiologická situácia v SR Trend výskytu salmonelóz za ostatných 10 rokov Proporcia etiologického agens Vekovošpecifická chorobnosť Sezonalita salmonelóz Výskyt salmonelóz podľa okresov za rok 2009 a Detekcia Salmonella sp. v potravinách Klasické kultivačné metódy Alternatívne metódy Metóda PCR Imunologické metódy, ELISA Cieľ práce Metodika práce a metódy skúmania... 33 3.1 TECRA UNIQUE TM Salmonella test Materiál potrebný na vykonanie testu Pomnožovanie vzorky Vykonanie testu Likvidácia odpadu Výsledky a diskusia Záver Zoznam použitej literatúry... 52 Zoznam ilustrácií Obr. 1 Trend výskytu salmonelóz za 10 rokov (URL 3) Obr. 2 Proporcia etiologického agens za rok 2010 (URL 3) Obr. 3 Vekovošpecifická chorobnosť za rok 2010 (URL 3) Obr. 4 Sezonalita za rok 2010 (URL 3) Obr. 5 Výskyt salmonelóz podľa okresov za rok 2009 (URL 3) Obr. 6 Výskyt salmonelóz podľa okresov za rok 2010 (URL 3) Obr. 7 TECRA UNIQUE TM Salmonella test (výrobca) Zoznam tabuliek Tab. 1 Pomnožovanie vzoriek (výrobca) Tab. 2 Inkubačné podmienky testu (výrobca) Tab. 3 Mikrobiologické vyšetrenie mäsa a mäsových výrobkov Tab. 4 Kritériá bezpečnosti potravín (ES č. 1441/2007) Zoznam skratiek a značiek AOAC (Association of Analytical Communitie) Asociácia oficiálnych analytických chemikov DNA kyselina deoxyribonukleová ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) enzýmová imunoadsorbentová analýza FAO (Food and Agriculture Organization) Organizácia OSN pre výživu a poľnohospodárstvo HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points) analýza nebezpečenstiev a kontrola kritických bodov JM jatočné mäso KTJ (= CFU) kolónia tvoriaca jednotku MMV mäkký mäsový výrobok MPPV modifikovaná pufrovaná peptónová voda PCR (Polymerase Chain Reaction) polymerázová reťazová reakcia PMV pečený mäsový výrobok TOSM tepelne opracované solené mäso TOŠ tepelne opracované šunky TTOMV trvanlivý tepelne opracovaný mäsový výrobok TTNMV trvanlivý tepelne neopracovaný mäsový výrobok USDA-FSIS (The Food Safety and Inspection Service) Služba potravinovej bezpečnosti a inšpekcie (USA) VM výrobné mäso VMV varený mäsový výrobok WHO (World Health Organization) Svetová zdravotnícka organizácia ZES Zollinger Ellisonov syndróm 10 Úvod Baktérie rodu Salmonella sp. sú pôvodcami alimentárneho ochorenia salmonelózy, ktoré vzniká najčastejšie po konzumácii kontaminovaných potravín. Najrizikovejšími potravinami, ktoré svojím zložením umožňujú rozmnožovanie salmonel, sú surové a tepelne nedostatočne opracované mäsá, bravčové, hovädzie alebo hydinové, ale aj suroviny a produkty živočíšneho pôvodu ako vajcia, zmrzlina, mlieko a majonézy. Najmä surové živočíšne produkty sú primárnym zdrojom infekcií, preto sú zavedené programy na monitorovanie salmonel na bitúnkoch a v chovoch. Salmonely sú tiež prenášané kontaminovanou vodou a infikovanými živočíchmi. Aj keď výskyt salmonel v SR za posledných desať rokov má klesajúcu tendenciu, v EÚ salmonely spôsobujú viac ako 35 % zo všetkých alimentárnych ochorení, pričom klesá výskyt sérotypu S. Enteritidis a zvyšuje sa výskyt sérotypu S. Typhimurium. Dôležité je nielen vykonávať kontrolu a dodržiavať hygienické požiadavky počas celého výrobného procesu, skladovania, manipulovania s potravinami a ich umiestňovania na trh, ale rovnako dôležité je sledovať kvalitu vstupných surovín, ktorá začína už u prvovýrobcu (zdravý chov, technológia chovu, hygiena chovu). Uplatňovanie všetkých zásad, požiadaviek a hygieny pri zabíjaní hospodárskych zvierat na bitúnkoch, vedie k získaniu mikrobiologicky kvalitnej suroviny. Z tohto dôvodu sa uplatňujú v kontrole technologického procesu a finálnej potraviny rýchle metódy, ktoré vyžadujú kratší čas získavania výsledkov, nenáročnosť na laboratórne vybavenie a vykonanie testov, pri analytických parametroch porovnateľných so štandardnými kultivačnými metódami. Takou metódou je aj TECRA UNIQUE Salmonella test, ktorá umožňuje získať výsledky do 22 hodín v porovnaní s horizontálnou metódou STN ISO 6579:2004, ktorá vyžaduje na získanie výsledkov 5 7 dní. Keďže TECRA UNIQUE Salmonella test je screeningová imunologická metóda je potrebné výsledky potvrdiť štandardnou kultivačnou metódou. 11 1 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí 1.1 Charakteristika rodu Salmonella Salmonella sp. sú tyčinkovité (1 x 2 µm) baktérie zaradené do čeľade Enterobacteriaceae, zväčša pohyblivé, nesporulujúce, schopné fermentovať glukózu, schopné intracelulárneho prežívania (Mastroeni et al. 2001; Dworkin a Falklow, 2006; Bhunia, 2008). Pohybujú sa pomocou peritrichálnych bičíkov. Výnimkou sú Salmonella enterica sérotyp Gallinarum a Salmonella enterica sérotyp Pullorum. Tie sú aj napriek tomu, že majú v genóme prítomné gény pre syntézu bičíkov nepohyblivé (Uzzau et al., 2000). Salmonely sú chemoorganotrofné baktérie. Metabolizmus majú ako respiračného, tak fermentatívneho typu. Fermentujú D glukózu za produkcie kyselín a plynu. Neskvasujú laktózu a sacharózu. Ako zdroj uhlíka využívajú zväčša citrát. Salmonely sú oxidáza pozitívne a reduktáza negatívne, produkujú sírovodík, redukujú nitrát, ale nehydrolyzujú močovinu (Bergey a Holt, 1994 ; Popoff a Le Minor, 2001). Salmonella sp. primárne prežíva v tráviacom systéme živočíchov (ľudí, vtákov, divých zvierat, hmyzu a pod.) a mnoho ľudí je permanentným, často asymptomatickým, prenášačom (Tauxe, 1991). V tele teplokrvných živočíchov je zvyčajne detegovaná S. enterica subsp. enterica, kým všetky ostatné poddruhy S. enterica a S. bongori prežívajú v chladnokrvných živočíchoch a iba zriedka infikujú ľudí (Dworkin a Falklow, 2006). Rod Salmonella sp. zahŕňa viac ako 2600 rôznych sérotypov gramnegatívnych fakultatívne anaeróbnych baktérií (Cary et al., 1999). Väčšina sérotypov rodu Salmonella sp. sú ubikvitárne a zapríčiňujú ochorenia u širokej škály hostiteľov (Janda a Abbott, 2006). 12 1.1.1 Taxonómia a nomenklatúra rodu Salmonella Prvýkrát bola Salmonella sp. izolovaná v roku 1885 z ošípaných Danielom E. Salomonom a bola označená ako Bacterium choleraesuis (dnes známa ako S. enterica serovar Choleraesuis) (Bhunia, 2008). Nomenklatúra rodu Salmonella až dodnes prechádza ustavičnými zmenami a môže byť zmätočná (Dworkin a Falklow, 2006). Molekulárno biologickými metódami sa zistilo, že jednotlivé sérotypy medzi sebou dosahujú homológiu 16S rrna a prevozných génov % a sú si teda veľmi podobné. Nejedná sa ale o samostatné druhy, ako sa doteraz predpokladalo (Macela et al., 2006). Pre porovnanie genetická príbuznosť Escherichia coli a Salmonella sp. je okolo % (URL 2). Pôvodné názvoslovie však nebolo založené na príbuznosti DNA, ale názvy druhov vychádzali z klinických prejavov, napr. Salmonella typhi, Salmonella choleraesuis. Po objavení sérologických analýz boli salmonely v roku 1946 zaradené do Kauffmann Whiteovej schémy, z čoho rezultovalo, že jednotlivé sérotypy boli považované za druhy. Neskôr boli názvy odvodzované od miesta, kde bol prvýkrát izolovaný kmeň novoobjaveného sérotypu, napr. Salmonella london, Salmonella panama (Todar, 2008). Kauffmann Whiteová schéma rozdeľuje druhy salmonel na základe sérologického identifikačného somatického (O antigén) a flagelárneho antigénu (H antigén). Antigénne vyjadrenie sérovarov salmonel definuje Svetová zdravotnícka organizácia (WHO), konkrétne Referenčné výskumné centrum pre salmonely v Pasteurovom inštitúte v Paríži (WHO Collaborating Centre). Nové sérovary sú uvádzané vo výročných aktualizáciách Kaufmann Whiteovej schémy (Brenner et al., 2000). V roku 2005 Medzinárodná komisia pre systematiku prokaryotov publikovala stanovisko, v ktorom oficiálne uznáva dva rody Salmonella bongori a Salmonella enterica, pričom Salmonella enterica obsahuje šesť poddruhov: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV) a indica (VI) (Janda a Abbott, 2006). Sérotypy druhu Salmonella enterica, ako napr. Typhimurium, by mali byť uvádzané ako Salmonella enterica subsp. enterica sérotyp Typhimurium. Z dôvodu stručnosti a jasnosti sa môže uviesť aj ako Salmonella sérotyp Typhimurium alebo Salmonella Typhimurium, pričom meno sérotypu sa uvádza s veľkým písmenom, avšak nie kurzívou (Dworkin a Falklow, 2006). Shelobolina et al. (2004) na základe analýzy 13 sekvencie 16S rdna charakterizujú aj tretí druh Salmonella subterranea. Novopopísaný druh je na základe analýzy sekvencie 16S rdna podobný so S. bongori na 96,4 % a s Enterobacter cloacae na 96,3 % Antigénna štruktúra Jednotlivé sérotypy sú založené na rôznej štruktúre O antigénu (termostabilný, somatický), H antigénu (termolabilný, bičíkový) a Vi antigénu (kapsulárny) (Dworkin a Falklow, 2006). Bičíkový H antigén je proteínovej povahy a je termolabilný. Vyskytovať sa môže v dvoch fázach, vzájomne sa líšiacich primárnou bielkovinovou štruktúrou. Prvá fáza je špecifická pre rôzne sérotypy, druhá je nešpecifická a je spoločná pre mnohé sérotypy (Matiasovicova et al., 2007). Väčšina salmonel je schopná exprimovať dva sérologicky odlišné bičíkové antigény (bifázické) (Burnens et al. 1996). O antigén salmonel je polysacharidovej povahy a je jedným z hlavných komponentov povrchu buniek. Jeho syntéza je kódovaná väčším počtom génov (Lee et al., 1992). Tretím antigénom, ktorý sa u tohto rodu baktérií rozlišuje, je kapsulárny Vi antigén. Tento antigén má polysacharidovú povahu a je zodpovedný za virulenciu. Vyskytuje sa však iba u S. Typhi a niekoľkých iných sérovarov, ako napríklad u S. Dublin a S. Hirschfeldii (Hashimoto et al., 1993) Prostredie pre rast a rozmnožovanie salmonel Salmonely dokážu rásť enormne rýchlo a prežívať aj v podmienkach, ktoré nie sú pre iné mikroorganizmy ani len hraničnými. Z tohto dôvodu sa dokážu množiť aj mimo hostiteľa, napríklad v potravinách. Najrýchlejšie rastú pri teplote C. Teploty dosahujúce záporných hodnôt ich ale neusmrcujú na rozdiel od teploty blížiacej sa k 70 C (Macela et al. 2006; El Gazzar a Marth, 1992; Bhunia, 2008). Celkovo dokážu vegetovať v širokej škále teplôt (8 45 C). Taktiež sušenie či zmrazovanie potravín negarantuje, že sa v nich nebudú nachádzať živé salmonely. Napríklad 20 % buniek Salmonella sérotyp Typhimurium možno zotaviť po deväťmesačnom zmrazení pri teplote 25 C (Janda a Abbott, 2006). Bóna (2000) uvádza, že rozmnožovanie 14 salmonel prestáva pri teplote 4 C, ale prežívajú aj v mrazených potravinách. Cabadaj et al., (1995) poukazuje na to, že v potravinárskom priemysle používané mraziarenské teploty nie sú schopné salmonely devitalizovať. Napr. Salmonella Typhimurium v zmrazenom kréme prežíva pri teplote 23 C šesť rokov a Salmonella Enteritidis až sedem rokov. Salmonely, aj keď patria medzi mezofilné patogény viazané predovšetkým na teplokrvné živočíchy, sú veľmi adaptabilné na podmienky vonkajšieho prostredia. Dlhodobo prežívajú v sušených potravinách a soľ, dusičnany, dusitany, ani kyselina askorbová v technologicky použiteľných koncentráciách nemajú na ich devitalizáciu žiadny vplyv (Golian, 1998). Patogén sa prostredníctvom výkalov živočíchov môže dostať aj do prostredia vody, kde môže prežiť niekoľko týždňov, či pôdy, kde môže prežiť aj niekoľko rokov a môže takto tvoriť rezervoár infekcie (Janda a Abbott, 2006). Pre rast salmonel je dôležitý i dostatok vody. Sušenie potravín len zastavuje ich rastovú aktivitu a umožňuje ich prežitie. Tak napr. salmonely v sušených výrobkoch môžu prežívať niekoľko týždňov, ale nerozmnožujú sa, kým sa nezvýši obsah vody v požívatine umožňujúci ich rozmnožovanie (Bóna, 2000). Laboratórnymi experimentmi americkí vedci testovali limity rastu Salmonella Typhimurium. Boli zistené minimálne hodnoty ph a vodnej aktivity, ktoré umožnili rast (ph 3,94, a w 0,942 pri teplote C). Pri teplotách nižších ako tento rozsah, minimálna hodnota ph a vodnej aktivity narastala so znižujúcou sa teplotou (Koutsoumanis et al., 2004). Bolo tiež zistené, že Salmonella enterica sérotyp Typhimurium dokáže získať väčšiu rezistenciu voči nízkemu ph a pravdepodobne aj voči iným negatívnym faktorom, ak je vystavená relatívne miernej kyslosti predtým, než sa podrobí koncentrovanejšiemu kyslému prostrediu. Rezistencia bola dokázaná napr. v jablkovom, pomarančovom i grapefruitovom džúse. Pasterizácia aplikovaná na tieto džúsy však zabezpečí termickú inaktiváciu baktérií bez ohľadu na zvýšenú rezistenciu voči kyselinám (Mazzota, 2001). Cabadaj et al., (1995) uvádzajú, že hodnoty ph 4,5 5,5 pôsobia na salmonely bakteriostaticky. Hodnoty ph 4 a nižšie sa považujú za baktericídne. Podľa Bhunia (2008) dokážu tieto baktérie rásť tiež pri ph 9,4. Pri skúmaní rezistencie voči antibiotikám, u salmonel izolovaných z hydiny, hovädzieho dobytka a ošípaných, bola zaznamenaná rezistencia voči tetracyklínu, amplicínu, streptomycínu, sulfónamidom a enrofloxacínu. Vyššia rezistencia bola pozorovaná pri Salmonella enterica sérotyp Typhimurium. Predpokladá sa, že rovnakú mieru rezistencie prejavuje tento patogén aj u človeka (European Commision, 2000). 15 1.2 Primárne antropogénne salmonely Pôvodcami salmonelóz bývajú netyfoidné salmonely, ktoré môžu spôsobovať gastroanteritídu, bakteriémiu alebo fokálnu infekciu (chronickú infekciu v oblasti mandlí). Viac ako 95 % infekcií netyfoidnými salmonelami pritom pochádza z potravín. Najčastejšie sa infekcia netyfoidnými salmonelami prejavuje ako gastroenteritída, prebiehajúca u väčšiny pacientov miene až asymptomaticky. Symptómy objavujúce sa po hodinách po požití kontaminovanej vody alebo potravy sú horúčka, zvýšená teplota, hnačka a kŕče v oblasti brucha. Závažnosť ochorenia a doba, kým sa prejavia príznaky, závisia od infekčnej dávky. U menej ako 5 % jedincov môže byť hnačka komplikovaná bakteriémiou. Spravidla pritom ide o ľudí nad 50 rokov (Darby a Sheorey, 2008). U ľudí a teplokrvných živočíchov je zvyčajne izolovaná Salmonella enterica subsp. enterica (Maza et al., 2004). Niektoré sérotypy sú primárne patogénne pre človeka a môžu vyvolať ochorenie nazývané týfus a paratýfus. Súhrnne sa takéto salmonely označujú ako primárne antropopatogénne. Všetky patria do prvého druhu S. enterica a väčšinou všetky do poddruhu S. enterica ssp. enterica. Napríklad kmene sérotypu Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B a Paratyphi C sú pôvodcami týfusu, resp. paratýfusu. Antigénna štruktúra S. Typhi je tvorená O antigénmi typu 9 a 12 a H antigénom typu d. Po penetrácii do črevnej sliznice začína inkubačná doba dlhá desať až štrnásť dní. Pri nej sa pôvodcovia rozmnožujú v mezenterických lymfatických uzlinách (Baumler et al., 1998). Týfus sa vyskytuje stále najviac v rozvojových krajinách Afriky, Južnej a Strednej Ameriky a v Indii (Threlfall, 2002). Tiež v rozvinutých krajinách spôsobujú baktérie rodu Salmonella veľké problémy. V EÚ sú salmonely zodpovedné za viac ako 35 % zo všetkých alimentárnych ochorení. V USA vyvolajú ročne až ochorení, z ktorých je 556 smrteľných (Nestle, 2003). Kingsley a Baumler, 2002 konštatujú, že v etiológii salmonelových ochorení u ľudí sa uplatňujú spravidla najmä S. Enteritidis a S. Typhimurium. Ostatné sérovary S. enterica subsp. enterica, sérovary ostatných poddruhov a druh S. bongori sa u ľudí vyskytujú iba veľmi vzácne. Boyen et al. (2008) uvádzajú, že v ostatnom období nastali rapídne zmeny v epidemiologickej situácii v rámci EÚ. Poukazujú na nárast netyfoidných infekcií u ľudí a konštatujú, že doposiaľ dominujúci sérovar S. Enteritidis (v 90 rokoch) je značne nahrádzaný sérovarom S. Typhimurium. Z ošípaných bývajú pritom izolované 16 rovnaké S. Typhimurium ako sa vyskytujú u ľudí, z čoho vyplýva pravdepodobnosť, že ošípané sú
Related Search
Similar documents
View more...
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks