Dipartimento di Farmacia

Description
UNIVERSITÀ DI PISA Dipartimento di Farmacia CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE Tesi di Laurea IDENTIFICAZIONE DI COMPOSTI ORGANICI VOLATILI DA PIANTE DEL GENERE SALVIA

Please download to get full document.

View again

of 142
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Information
Category:

Travel & Places

Publish on:

Views: 2 | Pages: 142

Extension: PDF | Download: 0

Share
Transcript
UNIVERSITÀ DI PISA Dipartimento di Farmacia CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE Tesi di Laurea IDENTIFICAZIONE DI COMPOSTI ORGANICI VOLATILI DA PIANTE DEL GENERE SALVIA DI UNA COLLEZIONE DELL ORTO BOTANICO DI PISA Relatore Prof. Guido Flamini Candidata Serena Pirozzi Correlatrice Dott.ssa Lucia Amadei Anno Accademico SSD: BIO/15 To Salvia In these time of fashionable rages Let us honor enduring sages. Known to cure, to mend, to ease; Companions to cooks; splendid teas. Hundreds of species our world adorn, Richly diverse in flower and form. Hail to salvia, that scented salvation, Worthy of study and our admiration. Andy Doty Riassunto Ventiquattro campioni del genere Salvia, facenti parte di una collezione di rilevanza nazionale dell'orto Botanico di Pisa, sono stati analizzati in vivo tramite la tecnica Head-Space Phase Micro- Extraction (HS-SPME) abbinata alla GC-MS (gas-cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa). Per conferma dell'identità di un composto presente in quantità rilevante è stata impiegata la tecnica della Risonanza Magnetica Nucleare (NMR). Si è proceduto all'estrazione dell'olio essenziale da otto di questi campioni tramite idrodistillazione in apparato tipo Clevenger. I profili di emissione dei composti organici volatili (VOC) dei diversi campioni sono stati valutati per mezzo dell'analisi Statistica Multivariata, in particolare con i metodi del clustering gerarchico (HCA) e delle componenti principali (PCA). L'elaborazione statistica è stata effettuata sia sulle percentuali dei singoli VOC, sia su quelle delle classi chimiche dei composti. I dendrogrammi ottenuti hanno permesso di raggruppare le diverse specie in base alla loro somiglianza chimica. Indice 1. Introduzione Materiali e metodi Prelievo dei campioni Head-Space Solid Phase Micro-Extraction (HS-SPME) Gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) Spettri di risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Distillatore tipo Clevenger Analisi statistica multivariata Il genere Salvia Inquadramento sistematico Classificazione botanica Famiglia delle Lamiaceae Distribuzione geografica, habitat e interesse Meccanismo a leva nell'impollinazione entomofila del fiore della Salvia Filogenetica del genere Salvia Disposizione areale dell'habitat delle specie prelevate Inquadramento sistematico delle specie analizzate appartenenti al genere Salvia Salvia amethystina subsp. ampelophylla (Epling) J.R.I. Wood&Harley Salvia aurita L.f Salvia blepharophylla Brandegee ex Epling Salvia clevelandii (A. Grey) Greene Salvia coccinea cv. Coral Nymph Salvia coccinea cv. Hummingbird Snow White Salvia dorisiana Standl Salvia forreri Greene Salvia fruticosa Mill Salvia gravida Epling Salvia haenkei Benth Salvia leucantha cv. Anthony Parker Salvia leucantha cv. Midnight Salvia leucophylla Greene Salvia macrophylla Benth Salvia madrensis Seem Salvia miltiorrhiza Bunge Salvia pauciserrata subsp. calocalicina (Briq.) J.R.I. Wood & Harley Salvia splendens cv. Van Houttei Salvia tingitana Etl Salvia tubifera Cav Salvia uliginosa Benth Salvia wagneriana Pol Salvia cv. Waverly Composizione dell'olio essenziale dei campioni in studio Salvia aurita L.f Salvia dorisiana Standl Salvia haenkei Benth Salvia leucantha cv. Midnight Salvia macrophylla Benth Salvia pauciserrata subsp. calocalicina (Briq.) J.R.I. Wood & Harley Salvia tubifera Cav Salvia cv. Waverly Risultati dell'analisi statistica Analisi statistica dell'emissione dei composti organici volatili dei bocci analizzati Analisi statistica dell'emissione dei composti organici volatili dei fiori analizzati 6.3. Analisi statistica dell'emissione dei composti organici volatili delle foglie analizzate Analisi statistica dell'emissione dei composti organici volatili degli oli essenziali analizzati Conclusioni Bibliografia Sitografia Allegato 1: lista delle tabelle Allegato 2: lista delle figure 1. Introduzione Nell'ambito delle Lamiaceae il genere Salvia viene incluso nella sottofamiglia Nepetoideae (Dumort.) Luerss. (1882), tribù delle Mentheae Dumort (1827), sottotribù delle Salviinae (Dumort.) Endl. (1838). Sono state classificate sinora più di 900 specie di Salvia, a cui si aggiungono decine di ibridi (di origine naturale e non) e centinaia di cultivar. Il genere Salvia è presente allo stato spontaneo in tutte le nazioni eccetto che in Australia (in cui si trovano alcune specie naturalizzate), con diffusione nelle regioni temperate e tropicali dei due emisferi ed escursioni altitudinali dal livello del mare a oltre 3400 m (Cervelli, 2011). Le specie oggetto di questo studio provengono da una collezione di rilevanza nazionale donata all'orto Botanico di Pisa dal vivaio di Lucca Le essenze di Lea . Provengono tutte da riproduzione per seme o talea; sono tutte erbacee perenni e, nei nostri climi, superano il periodo invernale comportandosi come camefite suffruticose. Per l'inquadramento sistematico delle singole specie analizzate, ho utilizzato la nomenclatura botanica accettata da due database online: l'international Plant Names Index (ipni.org) e The Plant List (theplantlist.com). Ho analizzato le ventiquattro specie prelevate mediante la tecnica Head-Space Solid Phase Micro- Extraction (HS-SPME) abbinata alla GC-MS (gas-cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa), la Spettrometria di Risonanza Magnetica Nucleare e l'idrodistillazione in distillatore tipo Clevenger. 4 2. Materiali e metodi 2.1. Prelievo dei campioni Il materiale oggetto di questa ricerca è stato prelevato presso l Orto Botanico di Pisa nel periodo compreso tra il 16/10/2014 e il 9/12/2014. Per effettuare i prelievi, sono state utilizzate delle apposite forbici a punta sottile per la recisione dei campioni, che venivano poi inseriti in contenitori di vetro inerte di volume consono alla quantità di materiale: - becher da 100 ml: generalmente utilizzati per raccogliere le foglie, in numero variabile da 2 a 6, in base alle dimensioni e all intensità dell emissione odorosa del campione; - becher da 50 ml: generalmente utilizzati per raccogliere i fiori, in numero variabile da 2 a 4, in base alle dimensioni e all intensità dell emissione odorosa del campione; - beute da 20 ml: generalmente utilizzate per raccogliere i bocci, in numero variabile da 3 a 6, in base alle dimensioni e all intensità dell emissione odorosa del campione. Dopo avervi inserito il campione, il contenitore di vetro veniva chiuso con dei fogli di alluminio fissati con degli elastici lungo il bordo per evitare il passaggio di aria da e verso l esterno. La permanenza del campione all interno del contenitore variava da mezz ora a 2-3 ore, in base alla quantità e all intensità odorosa dello stesso. Dato il periodo di tempo ravvicinato tra il prelievo e le fasi successive, le analisi condotte in questa ricerca sono da considerarsi effettuate in vivo. Per effettuare i prelievi delle piante da distillare per l'ottenimento dell'olio essenziale, sono state utilizzate apposite forbici da giardinaggio per la recisione dei campioni. Ogni campione veniva poi inserito e chiuso in buste di carta di grandezza consona alla quantità del materiale. Il campione prelevato veniva sistemato in un armadio essiccante chiuso e lasciato essiccare a temperatura ambiente per poi procedere con la distillazione. 5 2.2. Head-Space Solid Phase Micro-Extraction (HS-SPME) La Micro-Estrazione in Fase Solida (SPME) è una tecnica preparativa semplice, poco costosa e dotata di elevata sensibilità che non richiede l utilizzo di solventi. In seguito all inserimento nel contenitore ed alla sua chiusura, il campione rilascia dei composti organici volatili (VOC) nella fase aeriforme presente all interno del contenitore, detta spazio di testa (HS), instaurando quindi, un equilibrio. In questa tecnica, una speciale siringa viene utilizzata per forare la copertura del contenitore. Una volta all interno del contenitore, dall ago, cavo, viene estratta una fibra rivestita di fase adsorbente solida polimerica di polidimetilsilossano (PDMS), avente un diametro di 100 µm. La fibra è in contatto unicamente con lo spazio di testa circostante il campione, mai con il campione in sé, con cui non deve entrare in contatto. Il tempo di contatto tra la fibra e lo spazio di testa circostante il campione nel contenitore dipende da diversi fattori: generalmente, campioni più odorosi tendono a rilasciare maggiori quantità di VOC, quindi necessitano di tempi di campionamento più brevi; campioni con emissioni odorose più ridotte necessitano, in linea di massima, di tempi di contatto più lunghi. Tuttavia, ci sono delle eccezioni a questa regola, come nel caso di emissioni particolarmente rilevanti di VOC che però non evocano risposta olfattiva nell uomo. I tempi di contatto devono essere attentamente valutati, in quanto si deve stabilire un equilibrio significativo dal punto di vista quantitativo: la quantità di analita adsorbito dalla fibra, infatti, è direttamente proporzionale alla sua concentrazione nel campione. L adsorbimento, quindi, non deve essere troppo breve né troppo prolungato: entrambe le condizioni, infatti, generano scarsa significatività dal punto di vista quali-quantitativo e difficoltà di identificazione dei composti. Dopo il campionamento, la fibra viene trasferita nell'iniettore del gascromatografo associato allo spettrometro di massa: qui avviene il deadsorbimento termico dell analita e la separazione dei componenti Gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) Per la separazione dei costituenti della frazione volatile dei campioni è stato utilizzato un gascromatografo Varian CP I vantaggi dell utilizzo del gascromatografo per la separazione sono l alto potere risolutivo, la facile reperibilità dell equipaggiamento necessario, l attendibilità e la ripetibilità dei risultati, nonché i tempi di analisi relativamente brevi (Morelli, 2005). La fase mobile è rappresentata da Elio (He), utilizzato come gas di trasporto degli analiti deadsorbiti termicamente dalla fibra. La colonna capillare di separazione degli analiti è di tipo DB5, lunga 30 m 6 e di diametro interno 0,25 mm: è una colonna in silice fusa rivestita di poliammide, in cui la fase stazionaria, costituita da 5% bifenile e 95% dimetilpolisilossano, riveste l interno del tubo con uno spessore di 0,25 μm. La fase stazionaria è legata alla superficie interna della colonna tramite legami covalenti ed è stabilizzata da legami trasversali (Morelli, 2005). L inserimento della fibra nel gascromatografo avviene attraverso l iniettore, nel quale viene inserita la siringa da cui viene poi fatta uscire la fibra adsorbente. Il metodo utilizzato per l iniezione è lo splitless, in cui il campione iniettato vaporizza e viene trasportato nella colonna dal gas di trasporto: con questo metodo è possibile individuare anche sostanze presenti unicamente in tracce. La temperatura a livello dell iniettore è di 250 C. La colonna di separazione è contenuta in una camera termostatata, all interno della quale la temperatura aumenta in modo programmato: nelle condizioni analitiche utilizzate in questo studio, la temperatura di partenza è di 60 C, per poi aumentare di 3 C al minuto, fino ad arrivare a 240 C. Il rivelatore accoppiato al gascromatografo è uno spettrometro di massa Varian Saturn 2000 a trappola ionica. L identificazione dei costituenti si è basata sul confronto dei loro tempi di ritenzione con quelli di campioni puri, nonché sul confronto tra i loro Indici di Ritenzione Lineare (l.r.i.): il confronto è stato eseguito tramite software con i costituenti presenti nelle librerie commerciali NIST 98 e ADAMS 95 e tramite confronto visivo con librerie di spettri di massa di sostanze pure presenti in letteratura. Figura 1 Gascromatografo Varian CP-3800 e spettrometro di massa Varian Saturn 2000 a trappola ionica 7 2.4. Spettri di risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Gli spettri 1 H e 13 C NMR sono stati registrati con uno strumento Bruker Avance II operante in trasformata di Fourier ed equipaggiato con un magnete a superconduzione da 5.9 Tesla, e un sintetizzatore di radiofrequenza da 250 MHz per il protone e da 62.5 MHz per il 13 C. Gli spettri sono stati misurati in CDCl 3. I chemical shifts sono riportati in δ (ppm) rispetto al TMS (0 δ) impiegato come standard interno nel caso del CDCl 3 ; le costanti di accoppiamento (J) sono misurate in Hertz. Per gli spettri 13C- NMR è stato sempre usato come riferimento il segnale del solvente a 77.0 δ. Gli esperimenti DEPT sono stati eseguiti utilizzando trasferimenti di polarizzazione per mezzo di impulsi a 135 per ottenere segnali positivi per i gruppi CH e CH 3 e negativi per i calibrati su una costante di accoppiamento media C-H di 130 Hz. Figura 2 Strumento Bruker Avance II 2.5. Distillatore tipo Clevenger L'idrodistillazione è stata effettuata tramite l'apparecchiatura di Clevenger (Clevenger, 1928). Questa consiste in un pallone, inserito in un mantello riscaldante, in cui viene introdotto il materiale vegetale da distillare, precedentemente macinato in un mortaio, con acqua fino a riempire il pallone per circa la metà del suo volume. Il pallone è collegato mediante un raccordo a un refrigerante raffreddato ad acqua dove avviene la condensazione dei vapori. L'acqua contenuta nel pallone, riscaldata dal termomanto, evapora e attraversa la matrice provocando l'evaporazione degli oli essenziali in essa presenti. I vapori che si generano condensano: la loro immiscibilità in acqua e la 8 diversa densità, consentono il recupero degli oli essenziali. Al termine della distillazione della durata di 2 ore, è stato effettuato il recupero dell'olio essenziale con una siringa con ago flessibile data la minima quantità. In seguito, l'olio è stato diluito in n-esano per HPLC (circa 5-10%), trasferito in un vial e iniettato direttamente in GC-MS. Figura 3 Distillatore tipo Clevenger 2.6. Analisi statistica multivariata Le analisi statistiche sono state condotte con i software del pacchetto JMP (SAS Institute, Cary, NC, USA). L analisi mediante clustering gerarchico (HCA) è stata effettuata utilizzando il metodo Ward, usando distanze Euclidee quadratiche come misure di similarità (Flamini, 2014). I dati immessi sono rappresentati dalle percentuali dei singoli componenti identificati e, successivamente, quelle delle loro classi chimiche, confrontati tra loro in caso di provenienza da campioni omogenei. L'analisi delle componenti principali (PCA) consiste in una rappresentazione visiva dei dati, in cui le componenti principali (PC) sono determinate in modo da mantenere la maggior parte delle informazioni dei dati originali impostati nel minor numero possibile di nuove variabili, di solito due o tre. 9 3. Il genere Salvia Quando si parla di salvie quasi sempre il pensiero va alla salvia utilizzata in cucina (Salvia officinalis) detta anche salvia comune, madre salvia ed erba sacra, un suffrutice naturalizzatasi nei luoghi aridi e sassosi nel centro sud e in Sardegna. Il suo successo dipende dal suo profumo aromatico e la sua fama è tale da essere passata attraverso i secoli senza perdere troppo dell'aura di pianta magica, dalle proprietà terapeutiche indispensabili alla vita dell'uomo. Per i suoi principi amari è utilizzata come tonico-aromatica, stimolante della digestione. Essa agisce attivamente anche sul sistema nervoso, oltre ad avere un'azione astringente e antisettica (Sotti, 1997). Chi si interessa di specie ornamentali non può non pensare alla Salvia splendens, comune pianta annuale delle bordure primaverili. Abbastanza conosciute sono anche la Salvia sclarea (importante nel settore profumiero), la Salvia nemorosa (impiegata nei giardini soprattutto del Centro-Europa) e la Salvia farinacea (da alcuni decenni sviluppatasi come coltura annuale da bordura). Le salvie costituiscono un mondo ancora in larghissima parte sconosciuto, almeno in Italia, costituendo il più numeroso ma sicuramente non il più noto genere delle Labiate, famiglia comprendente molte altre specie aromatiche come i timi, il rosmarino, l'origano, la menta, la melissa, la santoreggia. L'uso delle salvie è testimoniato da secoli, se non da millenni, presso molti popoli e civiltà: la Salvia officinalis, impiegata almeno fin dall'epoca classica nel Bacino del Mediterraneo per scopi medicinali (l'uso alimentare è più recente); la Salvia miltiorrhiza, utilizzata in Cina contro malattie cardio-vascolari; la Salvia columbariae e la Salvia hispanica, i cui semi costituivano un'importante fonte nutritiva per gli Indios americani; la Salvia africana-caerulea, la cui efficacia curativa in problemi dell'apparato gastro-intestinale e respiratorio era conosciuta dagli aborigeni sudafricani. Numerose proprietà terapeutiche testimoniate dall'etnobotanica sono state confermate dalla moderna farmacologia; la ricerca di nuove sostanze chimiche a basso impatto sull'ambiente e sugli organismi viventi ha stimolato all'esplorazione del genere Salvia e ha portato alla scoperta di nuovi metaboliti secondari impiegabili, almeno potenzialmente, come antibatterici, antimicotici, antivirali, antiossidanti, antinfiammatori e antitumorali. Moltissime salvie hanno un caratteristico aroma del fogliame, come ad esempio la Salvia elegans, con foglie dal profumo di ananas, del quale sono responsabili specifiche sostanze terpeniche o differenti miscele di esse. Tali oli essenziali, hanno proprietà antimicrobiche utilizzate in campo erboristico e aromaterapico oltre che medicinale; hanno trovato recentemente impiego in campo agronomico e, per le loro proprietà antiossidanti e aromatizzanti, anche in campo alimentare. 10 In campo alimentare sono usate principalmente la Salvia dorisiana e la Salvia elegans. Nel settore ornamentale, la ricchezza di forme e colori e la variabilità nelle forme biologiche e nella adattabilità a diversi ambienti hanno visto, soprattutto negli ultimi dieci anni, una rilevante evoluzione varietale di salvie in quanto ritenute di elevato interesse per un consumo di massa (piante in vaso e annuali). Alcune specie sono dotate di elevata variabilità naturale (differenti colori del fiore, forme nane e compatte), adattabilità a cicli brevi e produzione standardizzate, quali, ad esempio la Salvia greggii, la Salvia Microphylla, la Salvia x jamensis, la Salvia patens e la Salvia leucantha (Cervelli, 2011). Studi eseguiti in vivo, con l'estratto e l'olio essenziale di Salvia officinalis, hanno evidenziato effetti ipotensivi nel gatto anestetizzato, azione deprimente del sistema nervoso centrale nel ratto anestetizzato e azione antispasmodica a livello dell'ileo della cavia. Basse dosi di olio di Salvia mostrano un'azione spasmogena iniziale da attribuirsi al contenuto di pinene (Newall, 1996). L'attività antimicrobica dell'olio essenziale è stata attribuita al contenuto in thujone, che in vitro è stata dimostrata contro l'escherichia coli, alcune specie di Salmonella e il Bacillus subtilis. L'olio essenziale si è rivelato anche antifungino, con attività in vitro contro vari funghi, tra i quali Candida albicans. La microincapsulazione dell'olio in capsule di gelatina e acacia ritarda l'insorgenza dell'azione antimicrobica e inibisce del tutto l'attività antifungina (Newall, 1996). Figura 4 Salvia officinalis L. (Köhler, 1887) 11 4. Inquadramento sistematico 4.1. Classificazione botanica Regno: PLANTAE Sottoregno: TRACHEOBIONTA Divisione: SPERMATOPHYTA Sottodivisione: MAGNOLIOPHYTA Classe: MAGNOLIOPSIDA Sottoclasse: ASTERIDAE Ordine: LAMIALES Famiglia: LAMIACEAE Sottofamiglia: NEPETOIDEAE Tribù: MENTHEAE Genere: Salvia 12 4.2. Famiglia delle Lamiaceae Con il nome di Lamiaceae o anche Labiatae si accorpa una vasta e omogenea famiglia di Dicotiledoni che comprende 200 generi e circa 7000 specie (theplantlist.org). Il carattere morfologico più evidente è dato dal lembo della corolla, incurvata sia all'interno che all'esterno, a ricordare la forma di un labbro, da cui il nome Labiatae . Sono piante prevalentemente erbacee, annuali o perenn
Related Search
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks