CRE CI MIEN TO DE Staphylo coccus au reus Y PRO DUC CIÓN DE EN TE RO TO XI NAS DU RAN TE LA MA NU FAC TU RA Y AL MA CE NA MIEN TO DE QUE SO TE LI TA - PDF

Description
Re vis ta Cien tí fi ca, FCV- LUZ / Vol. XXIV, Nº 3, , 2014 CRE CI MIEN TO DE Staphylo coccus au reus Y PRO DUC CIÓN DE EN TE RO TO XI NAS DU RAN TE LA MA NU FAC TU RA Y AL MA CE NA MIEN TO DE QUE

Please download to get full document.

View again

of 8
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Information
Category:

Products & Services

Publish on:

Views: 52 | Pages: 8

Extension: PDF | Download: 0

Share
Transcript
Re vis ta Cien tí fi ca, FCV- LUZ / Vol. XXIV, Nº 3, , 2014 CRE CI MIEN TO DE Staphylo coccus au reus Y PRO DUC CIÓN DE EN TE RO TO XI NAS DU RAN TE LA MA NU FAC TU RA Y AL MA CE NA MIEN TO DE QUE SO TE LI TA Growth and En te ro to xin Pro duc tion y Staphylo coccus au reus Du ring Ma nu fac tu re and Sto ra ge of Te li ta Type Chee se Eli sa et ta Luc ci 1, *, Clau dia Be na vi des 2, Li lian Spen cer 3, Al er to Paz 2,4 y Ro nald Mal do na do 5 1Uni ver si dad Si món Bo lí var. De par ta men to de Tec no lo gía de Pro ce sos Bio ló gi cos y Bio quí mi cos. 2 Uni ver si dad Si món Bo lí var. De ca na to de Es tu dios de Post gra do. 3 Uni ver si dad Si món Bo lí var. De par ta men to de Bio lo gía Ce lu lar. 4Uni ver si dad Me tro po li ta na. De par ta men to de Pro ce sos y Sis te mas. 5 Uni ver si dad Cen tral de Ve ne zue la. Fa cul tad de Agro no mía. Ins ti tu to de Quí mi ca y Tec no lo gía. * Au tor de co rres pon den cia: La o ra to rio de Mi cro io lo gía de Ali men tos. Dpto. Tec no lo gía de Pro ce sos Bio ló gi cos y Bio quí mi cos. Uni ver si dad Si món Bo lí var. Apar ta do Pos tal Ca ra cas 1080-A. Ve ne zue la. Tel.: Fax: eluc RE SU MEN Re ci i do: 29 / 07 / Acep ta do: 02 / 04 / El que so te li ta, es un que so ar te sa nal, lan co, fres co, de pas ta hi la da, pro du ci do en Ve ne zue la. Éste se ela o ra usualmen te con le che no pas teu ri za da, ajo un pro ce di mien to no estan da ri za do y se co mer cia li za a tem pe ra tu ra am ien te, por lo que la pre sen cia y cre ci mien to de pa tó ge nos cons ti tu ye un riesgo po ten cial. En este es tu dio se eva luó el cre ci mien to de Staphylo coccus au reus y la pro duc ción de en te ro to xi nas du rante la ma nu fac tu ra y al ma ce na mien to de que so te li ta. Los quesos fue ron ela o ra dos con le che ino cu la da con dos ni ve les, 10 3 y 10 5 UFC/mL de una cepa en te ro to xi gé ni ca de S. au reus, se fa ri ca ron si guien do el pro ce di mien to ar te sa nal y se al ma ce naron por 6 días (d) a dos tem pe ra tu ras (25 y 12 C). La po la ción de S. au reus se enu me ró du ran te la ma nu fac tu ra (aci di fi ca ción, cua ja da, sa la zón y coc ción) y al ma ce na mien to (2; 4 y 6 d). Se de ter mi nó la pre sen cia de en te ro to xi nas A y B me dian te in munoen sa yo de aglu ti na ción pa si va re ver sa (SET RPLA). En la ma nu fac tu ra, la po la ción de S. au reus dis mi nu yó (P 0,05) duran te la eta pa de coc ción- hi la do, cuan do la tem pe ra tu ra en el in te rior del que so fue de 70 C/10min. Du ran te el al ma ce na miento, la re fri ge ra ción con tro ló la po la ción del mi cro or ga nis mo dismi nu yen do el nú me ro de cé lu las via les en un ci clo lo ga rít mi co a par tir del día 2, mien tras a tem pe ra tu ra am ien te se in cremen tó (P 0,05) al can zan do va lo res de 10 7 y 10 6 UFC/g a los 2 y 4 d, con ni vel de po la ción ini cial de 10 5 y 10 3 UFC/g, res pecti va men te. En te ro to xi nas A y B se de tec ta ron so la men te en las mues tras al ma ce na das a 25 C con po la cio nes de 10 7 UFC/g. En este es tu dio la tem pe ra tu ra/tiem po du ran te la coc ción- hi lado y la re fri ge ra ción en el al ma ce na mien to in flu ye ron sig ni fi ca tiva men te (P 0,05) en el cre ci mien to y so re vi ven cia de S. aureus. Es tos ha llaz gos per mi ten re co men da cio nes pre ven ti vas para me jo rar la ino cui dad del pro duc to. Pa la ras cla ve: Que so te li ta, Staphylo coccus au reus, en te roto xi nas es ta fi lo có ci ca, in mu noen sa yo por aglu ti na ción pa si va re ver sa. ABS TRACT Te lita is an ar ti san, white, cooked paste fresh cheese pro duced in Vene zuela. Com monly, it is made from un pasteur ized milk fol low ing a not stan dard ized pro ce dure and marketed at room tem pera ture, there for pres ence and growth of patho gens is a po ten tial risk. The goal of this study is was to es ta lish Staphy lo coc cus au reus grown rate and entero tox ins pro duc tion dur ing te lita cheese mak ing and stor age. Cheese sam ples are made us ing con tami nated milk con tain ing two differ ent doses, 10 3 and 10 5 CFU/mL of a strain entero toxi genic of S. au reus, fol low ing a tra di tional pro ce dure and stored for 6 days at two dif fer ent tem pera tures, 25 and 12 C. The popu lation of S. au reus is de ter mined dur ing manu fac ture (acidi fi cation, curding, salt ing and cook ing) and stor age at days (d) 2, 4, and 6. Ad di tion ally, the pres ence of entero tox ins A and B is meas ured y re verse pas sive ag glu ti na tion im mu no as say 205 Cre ci mien to de S. au reus y pro duc ción de en te ro to xi nas en que so Te li ta / Luc ci, E. y col. (SET RPLA). Dur ing te lita type cheese manu fac ture, the popula tion of S. au reus de creased (P 0.05) while cook ing at 70 C/10min. In stor age, mi cro or gan ism popu la tion is con trolled y re frig era tion, re duc ing the numer of vi ale cells in one log cy cle af ter day 2. How ever, at room tem pera ture an in crease (P 0.05) of the mi cro or gan ism popu la tion is o served, reaching fi nal val ues of 10 7 and 10 6 CFU/g, af ter to 2 and 4 d storage, re spec tively, from sam ples with ini tial popu la tion level of 10 5 and 10 3 CFU/g, re spec tively. Entero tox ins A and B were de tected only in 10 7 CFU/g sam ples stored at 25 C. This study shows that cook ing tem pera ture/time and re frig er ated tem perature through out stor age, sig nifi cantly in flu enced (P 0.05) growth and sur vival of S. au reus. These find ings al lows preven tive rec om men da tions for ar te sian cheese- makers to help im prove prod uct safety, use a cook ing time re la tion ship of 70 C/10min and a store tem pera ture of 12 C. Key words: Te li ta- type chee se, Staphylo coccus au reus, en tero to xin pro duc tion, re ver se pas si ve la tex agglu tina tion immu noas say. IN TRO DUC CIÓN Staphylo coccus au reus es uno de los prin ci pa les mi croor ga nis mos in vo lu cra dos en in to xi ca cio nes ali men ta rias a ni vel mun dial [22]. La le che [5, 45] y pro duc tos lác teos, es pe cialmen te que sos ela o ra dos con le che cru da o su pas teu ri za da, han sido los ali men tos usual men te im pli ca dos en los ro tes [14, 32, 39]. La in to xi ca ción es ta fi lo có ci ca, ocu rre por la in ges tión de pe que ñas can ti da des (20ng-1µg) [35] de una o más en te ro to xinas es ta fi lo coc ci cas (SEs) pre for ma das en el ali men to con ta - mi na do con S. au reus. Se han iden ti fi ca do 21 ti pos an ti gé ni cos de SEs [3, 26], de és tas, las de no mi na das clá si cas (SEA a SEE) se han aso cia do a en fer me da des trans mi ti das por alimen tos (ETA), sien do SEA la que se ha re por ta do más fre - cuen te men te [3, 45, 46]. La pre va len cia de S. au reus en que sos se ha aso cia do al uso de le che cru da o su pas teu ri za da, o a la con ta mi na ción por fuen tes hu ma nas du ran te el pro ce so de ela o ra ción [3, 25, 32]. S. au reus pue de es tar pre sen te en la le che de i do al orde ño de ani ma les con mas ti tis clí ni ca o su clí ni ca [7, 43] y/o por ina de cua das prác ti cas hi gié ni cas du ran te la o ten ción [24, 43]. Adi cio nal men te, con di cio nes de fi cien tes de re fri ge ra ción y pro lon ga dos pe río dos de al ma ce na mien to pue den fa vo re cer el cre ci mien to del mi cro or ga nis mo a ni ve les de po la ción con side ra dos ries go sos ( 10 5 UFC/mL) por pro du cir SE en can ti dad su fi cien te para una ETA [22]. El que so tipo te li ta es un que so lan co fres co de pas ta hi la da, de pro duc ción ar te sa nal. Du ran te su ma nu fac tu ra, el uso de le che pas teu ri za da, tal como lo es ta le ce la Nor ma ti va Ve ne zo la na CO VE NIN 3822:03 [13] cons ti tu ye una me di da efec ti va para eli mi nar S. au reus, así como otros mi cro or ga nismos pa tó ge nos no es po ru la dos. Sin em ar go, esta no es una prác ti ca co mún [9], de i do a que en la ela o ra ción de este tipo de que so, no se uti li zan cul ti vos ini cia do res. El pro ce so de coa gu la ción uti li za do es esen cial men te en zi má ti co [4, 9] y las ca rac te rís ti cas pro pias de sa or y aro ma del pro duc to resul tan del agre ga do de sue ro áci do pro ve nien te de una produc ción an te rior [9], por lo que la io ta na ti va de la le che tie ne un rol en el de sa rro llo de las cua li da des sen so ria les. Por otra par te, la pas teu ri za ción de la le che no pre vie ne la con ta mi na ción que pue de ocu rrir du ran te el pro ce so de manu fac tu ra del que so, don de las ca rac te rís ti cas fi na les, ph cerca no a la neu tra li dad, ajo con te ni do de sal y alta ac ti vi dad de agua (a w ), así como, la co mer cia li za ción sin re fri ge ra ción, favo re cen la su sis ten cia y mul ti pli ca ción de S. au reus y la produc ción de SEs, re pre sen tan do un ries go para la sa lud de los con su mi do res [32]. Es tu dios de la ca li dad mi cro io ló gi ca de que so te li ta han re por ta do pre sen cia de S. au reus [28, 29] y de SEs en mues tras con po la cio nes 10 3 UFC/g [28]. El cre ci mien to de S. au reus y la pro duc ción de SEs duran te la ma nu fac tu ra de que sos ha sido pre via men te eva lua da [2, 20, 31, 33, 37, 41], y los re sul ta dos va rían de pen dien do del pro ce di mien to de ma nu fac tu ra y las ca rac te rís ti cas in trín se cas del que so. Por lo que en este es tu dio se plan teó como o je tivo eva luar el cre ci mien to de S. au reus y la pro duc ción de SEs du ran te la ma nu fac tu ra y al ma ce na mien to del que so ar te sa nal tipo te li ta. MA TE RIA LES Y MÉ TO DOS Cepa y con di cio nes de cul ti vo Staphylo coccus au reus, una cepa pro duc to ra de en te roto xi nas A y B (do na da por la Dra. As trid Miró, Dpto. de Mi croio lo gía de Ali men tos, Ins ti tu to Na cio nal de Hi gie ne Ra fael Ran gel, Ca ra cas, Ve ne zue la) fue ais la do de que so lan co de pro duc ción ar te sa nal in vo lu cra do en un ro te ocu rri do en el año La cepa fue reac ti va da en cal do ce re ro co ra zón (CCC, Merck) a 35 C por 24 h y se ve ri fi có la pu re za en agar Baird Par ker (BP, Difco) su ple men ta do con emul sión de yema de hue vo al 50% y te lu ri to de po ta sio al 1%, in cu a ndo (GCA Pre ci sion Scien ti fic, Thel co 6M, EUA) a 35 C por 48 h, o tenien do solo co lo nias tí pi cas en BP, las cua les fue ron con firma das por mor fo lo gía mi cros có pi ca, Gram, ca ta la sa, oxi da sa, coa gu la sa y el sis te ma API Staph (API, BioMèrieux, Fran cia) (por cen ta je de iden ti fi ca ción de 97,8). La pro duc ción de to xinas se ve ri fi có por el mé to do de aglu ti na ción en lá tex pa si va re ver sa (SET RPLA, Oxoid, Ale ma nia) de acuer do a pro ce di - mien to des cri to pos te rior men te. El cul ti vo se man tu vo en agar trip ti ca sa de soya (ATS, Merck) has ta su uso. Pre pa ra ción del inó cu lo Un cul ti vo de 18 h de S. au reus en CCC se cen tri fu gó a 7537g por 10 min en una mi cro cen trí fu ga (Fisher Scien ti fic, Mi cro14, EUA), se la va ron las cé lu las dos ve ces en so lu ción 206 Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXIV, Nº 3, , 2014 sa li na al 0,85% (p/v) y se re sus pen dió has ta una As 600nm ~0,3714 (Agi lent Te chno lo gies, Cary 50 UV- Vis, EUA), para o te ner una po la ción ~10 8 UFC/mL, pre via men te es tan da ri zada por re cuen to de cé lu las via les en ATS a 35 C por 48 h. A par tir de esta sus pen sión se rea li za ron di lu cio nes en le che este ri li za da (110 C por 10 min), para la con ta mi na ción de la leche mo di fi ca da uti li za da en el ex pe ri men to mo de lo y de la leche pas teu ri za da uti li za da en la ma nu fac tu ra de los que sos. Cre ci mien to y pro duc ción de en te ro to xi nas en le che mo di fi ca da Se eva luó el cre ci mien to, la pre sen cia de SEs y la re sisten cia tér mi ca de la cepa de S. au reus en un ex pe ri men to mode lo, uti li zan do le che es te ri li za da su ple men ta da con 3% de clo ru ro de so dio y ajus ta da a ph 6,08 para si mu lar las ca rac terís ti cas fi si co quí mi cas del que so tipo te li ta. La le che (3%NaCl;pH6,08) fue con ta mi na da con dos ni ve les de po la ción de S. au reus para o te ner una con cen tra ción fi nal aja 10 1 o alta 10 3 UFC/mL. Las mues tras con ta mi na das se al ma ce naron a dos tem pe ra tu ras (am ien te 25 ± 2 C y re fri ge ra ción 12 ± 2 C) por 6 d, rea li zan do enu me ra ción de S. au reus cada 48 h en ATS in cu a do a 35 C por 48 h y la de tec ción de SEs por RPLA. La re sis ten cia tér mi ca se de ter mi nó a 65 C, tem pe ra tura pro me dio de coc ción del que so te li ta. Ma nu fac tu ra del que so te li ta Los que sos fue ron ela o ra dos en una plan ta pi lo to de la Fa cul tad de Agro no mía de la Uni ver si dad Cen tral de Ve ne zuela, Ma ra cay, es ta do Ara gua, si guien do el pro ce di mien to de ma nu fac tu ra ar te sa nal, uti li zan do le che de vaca ( Bos tau rus) pas teu ri za da ad qui ri da en la em pre sa Lac tua rio de Ma ra cay C.A. La le che se man tu vo re fri ge ra da a 5 C has ta su uso (~24 h) y se le de ter mi nó ae ro ios me só fi los y co li for mes to ta les según re qui si tos mi cro io ló gi cos de la Co mi sión Ve ne zo la na de Nor mas In dus tria les (CO VE NIN 798:94) [12] y S. au reus por el Mé to do del Nú me ro Más Pro a le (NMP) si guien do la me to dolo gía des cri ta por CO VE NIN 1292:04 [10]. Se pre pa ra ron tres lo tes de que so de pas ta hi la da, uti lizan do 20 L de le che para cada uno. Cada lote de le che se calen tó has ta 35 C y se se pa ró en dos vo lú me nes de 10 L para su con ta mi na ción. Se uti li za ron dos ni ve les de inó cu lo de S. au reus, para o te ner con cen tra cio nes fi na les en la le che de 10 3 UFC/mL (ni vel ajo) y 10 5 UFC/mL (ni vel alto). La le che se man tu vo en re po so por 45 min. Se agre gó sue ro aci di fi ca do ph 3,45-3,84 en una pro por ción del 10% (p/v) para o te ner un ph en la mez cla ~5,8 y se agre gó 0,4 g de cua jo co mer cial (CHY- MAX, Chr. Han sen, Ale ma nia), se agi tó len ta men te por 10 min y se dejó re po sar has ta com ple tar la coa gu la ción. Poste rior men te, se cor tó el gel de pa ra ca se i na to fos fa to cál ci co para o te ner la cua ja da y se pro ce dió al de sue ra do par cial utili zan do un con te ne dor per fo ra do. Se pesó (AND Elec tro nic alan ce, FY- 2000, Ja pón) y se agre gó clo ru ro de so dio (NaCl) has ta al can zar una con cen tra ción del 3% en ase al peso de la cua ja da. Se pren só y mol deo por ca len ta mien to has ta lo grar una masa hi lan te y ho mo gé nea (60-70 C por 10 min), con sisten cia tí pi ca de este tipo de que so. El pro duc to ter mi na do se en frió a tem pe ra tu ra am ien te y se em pa có en ol sas de polie ti le no con cie rre her mé ti co. Los que sos se al ma ce na ron a 12 ± 2 y 25 ± 2 C por 6 d. Las ca rac te rís ti cas fi na les de los que sos fue ron ph: 6,0 y 7,0 (ph- Fix 0-14, Ma che rey- Na gel, Ale ma nia), a w : 0,973 ± 0,002 (Deca gon De vi ces, CX-1, EUA) y aci dez ti tu la le: 0,16 ± 0,009 se gún me to do lo gía CO VE NIN 658:97 [11]. Las de termi na cio nes fue ron rea li za das por tri pli ca do. Aná li sis mi cro io ló gi co Se rea li zó enu me ra ción de S. au reus en las mues tras de: 1) Le che pas teu ri za da an tes de con ta mi nar, 2) Le che pasteu ri za da con ta mi na da, 3) Le che des pués de agre gar el sue ro (aci di fi ca ción), 4) Cua ja da, 5) Cua ja da des pués de la sa la zón, 6) Que so ter mi na do y en el 7) Que so du ran te el al ma ce namien to a 12 y 25 C en los tiem pos 2; 4 y 6 d. La po la ción de S. au reus se de ter mi nó por el mé to do de re cuen to di rec to en pla ca si guien do me to do lo gía des cri ta por CO VE NIN 1292:04 [10]. Se pe sa ron asép ti ca men te 50 g de mues tra y se le agre ga ron 450 ml de agua pep to na da al 0,1% u fe ri za da su ple men ta da con 2% de ci tra to de so dio (JT Ba ker), se mez cló en un ho mo ge ni za dor (La- Blen der, Stoma cher 400, In gla te rra) por un min y se rea li za ron di lu cio nes se ria das en agua de pep to na al 0,1% u fe ri za da. 1 ml de cada di lu ción se dis tri u yó, por du pli ca do, en la su per fi cie de tres pla cas con agar BP y se in cu ó a 37 C por 48 h. Las colo nias con ca rac te rís ti cas tí pi cas, 1 a 3 mm, co lor ne gro rillan tes con o sin do le halo fue ron enu me ra das y con fir ma das me dian te tin ción Gram, ca ta la sa y coa gu la sa. Los re sul ta dos se ex pre sa ron como Log (UFC/mL o g). De tec ción de en te ro to xi nas La pre sen cia de SEs (SEA y SEB) se de ter mi nó uti li zando un in mu noen sa yo de aglu ti na ción pa si va re ver sa para detec ción de en te ro to xi nas es ta fi lo coc ci cas (SET RPLA, Oxoid). 10 g de mues tra se ho mo ge nei za ron ( La- Blen der, Sto macher 400, In gla te rra) con 10 ml de so lu ción sa li na al 0,85% (p/v) por 1 min, se cen tri fu ga ron a 6105g por 30 min a 4 C y se fil tró el so re na dan te a tra vés de una mem ra na de 0,22 µm (Mi lli po re, Mi llex- GV, EUA). Se co lo ca ron 25 µl del di luyen te en cada po ci llo de la pla ca de mi cro ti tu la ción y 25 µl de la mues tra en el pri mer po ci llo, a par tir del cual se rea li za ron di lu cio nes do les has ta 1:8. Se ho mo ge nei zó por 1 min en un agi ta dor (Hei dolph, Tri ta max 101, Ale ma nia) y se agre ga ron 25 µl del lá tex sen si i li za do con las SEs a en sa yar. Se rea lizó el con trol del di lu yen te en las mis mas con di cio nes. Las placas fue ron in cu a das en cá ma ra hú me da a 35 C por 24 h. Di se ño ex pe ri men tal y aná li sis es ta dís ti co Se uti li zó un di se ño ex pe ri men tal com ple ta men te alea to riza do con tres re pe ti cio nes. Para eva luar el cre ci mien to de S. au- 207 Cre ci mien to de S. au reus y pro duc ción de en te ro to xi nas en que so Te li ta / Luc ci, E. y col. reus y el tiem po de de tec ción de SEs (SEA- SEB), los tra ta mientos fue ron dis pues tos en un arre glo fac to rial 2 2 (ni ve les de ino cula ción ini cial y tem pe ra tu ras de al ma ce na mien to). Las cur vas de cre ci mien to se ajus ta ron uti li zan do un mo de lo li neal mix to y la prue a de com pa ra ción múl ti ple de Di Rien zo, Guz mán y Casano ves (DGC) [16]. Para eva luar el com por ta mien to de S. au reus du ran te el pro ce so de ma nu fac tu ra del que so te li ta, los tra ta mien tos con sis tie ron en las cua tro eta pas del pro ce so de ma nu fac tu ra y los re sul ta dos fue ron ana li za dos uti li zan do un ANO VA de una vía y la prue a de com pa ra ción múl ti ple DGC. To dos los aná li sis se rea li za ron uti li zan do In fos tat 2013 [15]. RE SUL TA DOS Y DIS CU SIÓN Cre ci mien to y pro duc ción de en te ro to xi na A en le che mo di fi ca da Los re sul ta dos del cre ci mien to de S. au reus y pro ducción de en te ro to xi na en le che (3%NaCl;pH6,08) al ma ce na da en dos tem pe ra tu ras (25 y 12 C) se mues tran en la FIG Nivel ajo de inóculo a 12 C Nivel ajo de inóculo a 25 C Nivel alto de inóculo a 12 C Nivel alto de inóculo a 25 C Enterotoxina A Tiempo de almacenamiento (horas) FI GU RA 1. CRE CI MIEN TO DE S. au reus Y PRE SEN CIA DE EN TE RO TO XI NA A (SEA) EN LE CHE MO DI FI CA DA ( 3% NaCl; ph 6,08) SO ME TI DA A DOS NI VE LES DE INÓ CU LA CIÓN INI CIAL Y DOS TEM PE RA TU RAS DE AL MA CE NA MIEN TO. LA FLE- CHA IN DI CA LOS DA TOS EN QUE SE DE TEC TÓ SEA. La po la ción de S. au reus au men tó sig ni fi ca ti va men te (P 0,05), al can zan do un va lor de ~8,4 Log (UFC/mL) a las 96 h en las mues tras al ma ce na das a 25 C, in de pen dien te men te del ni vel ini cial en la le che (10 1 o 10 3 UFC/mL), pro du cien do en te ro to xi na A (SEA) en can ti da des de tec ta les al al can zar esta po la ción. Mien tras en la le che (3%NaCl;pH6,08) al ma ce na da a 12 C, se con tro
Related Search
Similar documents
View more...
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks