Академiк НАН України В.С. Пiдгорський, О. Г. Коваленко, П.М. Болтовець, Б.А. Снопок, О. М. Полiщук - PDF

Description
УДК :578.86:535.7 Академiк НАН України В.С. Пiдгорський, О. Г. Коваленко, П.М. Болтовець, Б.А. Снопок, О. М. Полiщук Формування комплексу глюкуроноксиломанану Tremella mesenterica Ritz. Fr. з вiрусом

Please download to get full document.

View again

of 8
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Information
Category:

Magazines/Newspapers

Publish on:

Views: 22 | Pages: 8

Extension: PDF | Download: 0

Share
Transcript
УДК :578.86:535.7 Академiк НАН України В.С. Пiдгорський, О. Г. Коваленко, П.М. Болтовець, Б.А. Снопок, О. М. Полiщук Формування комплексу глюкуроноксиломанану Tremella mesenterica Ritz. Fr. з вiрусом тютюнової мозаїки як один iз можливих механiзмiв антивiрусної дiї полiсахариду Встановлено, що глюкуроноксиломанан (ГКМ), видiлений iз культуральної рiдини базидiального гриба Tremella mesenterica Ritz. Fr. (Basidiomycota), пригнiчує iнфекцiйнiсть вiрусу тютюнової мозаїки (ВТМ). Iнактивацiя вiрусу є зворотною, оскiльки зменшується при розведеннi iнокулюма, до якого був доданий ГКМ. За допомогою методу поверхневого плазмонного резонансу показано, що ГКМ взаємодiє з вiрусними частками in vitro. Причиною зниження iнфекцiйностi вiрусу в присутностi ГКМ може бути агрегацiя вiрiонiв, яка виявляється при ультрацентрифугуваннi сумiшi в градiєнтi густини сахарози та за допомогою трансмiсивної електронної мiкроскопiї. Серед завдань прикладної фiтовiрусологiї важливим є пошук речовин можливих засобiв захисту рослин вiд вiрусних iнфекцiй. За типом активностi антивiруснi препарати подiляють на iнактиватори, що впливають безпосередньо на вiрус, iнгiбiтори iнфекцiї i репродукцiї вiрусiв та iндуктори вiрусостiйкостi рослин. Серед iнгiбiторiв вiрусiв вiдомi бiлки, полiсахариди, аналоги нуклеотидiв, нуклеїнових кислот, нуклеозидiв, неорганiчнi сполуки тощо [1]. Останнiм часом в галузi пошуку антивiрусних препаратiв все бiльше уваги придiляється iндукторам стiйкостi рослин, якi пригнiчують розвиток вiрусної iнфекцiї у рослин внаслiдок активацiї захисних механiзмiв хазяїна [2]. Здатнiсть iндукувати вiрусостiйкiсть у рослин виявлено у ряду нуклеїнових кислот, бiлкiв та полiсахаридiв [3, 4]. Серед останнiх найбiльший iнтерес становлять глiкополiмери, що легко утилiзуються рослиною та мiкроорганiзмами i тому є нешкiдливими як для самої рослини, так i для довкiлля в цiлому. Так, на прикладi вiрусу тютюнової мозаїки (ВТМ) показано, що нейтральнi манани, продукованi дрiжджами, можуть перешкоджати утворенню вiрусiндукованих локальних некрозiв у надчутливого сорту тютюну, але не впливають на розвиток первинних центрiв iнфекцiї у сприйнятливого сорту [3]. На пiдставi цих та iнших даних авторами було висунуто припущення, що антивiруснi властивостi таких полiсахаридiв зумовленi їх здатнiстю сприяти активацiї захисних механiзмiв, що базуються на бiлок-вуглеводнiй взаємодiї, яка не потребує активацiї клiтинного геному та синтезу нових речовин у клiтинi [4]. З iншого боку, деякi вуглеводвмiснi сполуки, як наприклад, глiкопротеїн, видiлений з плодових тiл їстiвного гриба Agrocybe aegerita, що має лектиновi властивостi, можуть пригнiчувати розвиток ВТМ-iнфекцiї у рослинах Nicotiana glutinosa завдяки прикрiпленню до вiрусної частки та перешкоджанню процесу iнфiкування рослинної клiтини вiрусом [5]. Дослiдження антифiтовiрусних властивостей глюкуроноксиломанану (ГКМ), видiленого з культуральної рiдини Tremella mesenterica, показали, що даний глiкан може пригнiчувати ВТМ-iнфекцiю у надчутливих рослин як при додаваннi його до суспензiї вiрусу, так В. С. Пiдгорський, О.Г. Коваленко, П.М. Болтовець, Б.А. Снопок, О.М. Полiщук, 2013 ISSN Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2013, i при введеннi його в мiжклiтинний простiр листка [6]. Причому остання активнiсть частково блокується в присутностi iнгiбiтора транскрипцiї РНК на матрицi ДНК актиномiцину Д [7]. Це дало можливiсть припустити, що ГКМ впливає як на вiрус in vitro, так i на процеси клiтинного метаболiзму, що призводять до активацiї вiрусостiйкостi рослин de novo. Ми ставили за мету вивчення взаємодiї ГКМ з вiрiонами (антигеном) ВТМ як умови, за якої може вiдбуватися iнактивацiя вiрусу завдяки утворенню неiнфекцiйних комплексiв in vitro. Матерiали i методи. Об єктами дослiджень були: ВТМ, штам U 1 та полiсахарид ГКМ, видiлений з культуральної рiдини гриба Tremella mesenterica Ritz. Fr. (Heterobasidiaceae) за методикою [8] з деякими модифiкацiями. Бiологiчнi дослiдження. Для визначення антивiрусної активностi ГКМ використовували рослини дурману (Datura stramonium L.), вирощенi в теплицi за природних умов освiтлення, вологостi та температури. У дослiдi використовували рослини у вiцi 4 6 справжнiх листкiв. Для дослiдження здатностi ГКМ взаємодiяти з ВТМ in vitro, полiсахарид (2 мг/мл) додавали до водної суспензiї вiрусу (20 мкг/мл) та витримували рiзнi промiжки часу (0, 5, 10, 15, 30 с та 1, 5, 10 хв), пiсля чого iнокулювали лiвi половинки листкiв дурману. Правi половинки, якi слугували контролем, iнокулювали вiрусом без препарату. Зворотнiсть iнактивацiї вiрусу в присутностi полiсахариду вивчали за допомогою послiдовних п ятикратних розведень iнкубованої протягом 30 хв сумiшi ГКМ (5 мг/мл) ВТМ (2 мг/мл). Правi половинки iнокулювали вiрусом у вiдповiдному розведеннi без додавання препарату. Ступiнь пригнiчення вiрусної iнфекцiї розраховували за кiлькiстю некрозiв на дослiднiй i контрольнiй половинках листкiв за формулою [9] I = K Д K 100%, де I ступiнь iнгiбування вiрусу, %; К кiлькiсть некрозiв у контролi; Д кiлькiсть некрозiв у дослiдi. Результати пiдрахунку некрозiв та достовiрнiсть отриманих результатiв пiддавали статистичнiй обробцi загальновiдомими методами. На графiках подавали вiдхилення середньої величини вiдношення кiлькостi некрозiв у дослiдi до такої у контролi. Метод поверхневого плазмонного резонансу (ППР). Для вивчення утворення комплексу мiж полiсахаридом та вiрiонами ВТМ in vitro застосовували метод ППР [10]. Для реалiзацiї методу ми використовували специфiчнiсть бiлка А Staphylococcus aureus до Fc-фрагменту iмуноглобулiну, з одного боку [11], та формування попередньо утвореного комплексу вiрусу з вiрусоспецифiчними антитiлами, з iншого. Залежно вiд вiдносної концентрацiї вiрусних часток та вiрусспецифiчних антитiл, комплекси IgG вiрус можуть мати рiзну кiлькiсть IgG на один вiрiон, що обумовлює варiацiї щiльностi як всерединi самого комплексу, так i в їх упаковцi на поверхнi; при цьому середня товщина всього комплексу буде приблизно однаковою внаслiдок статистичного характеру взаємодiї антивiрусних iмуноглобулiнiв iз системою вiдповiдних епiтопiв на поверхнi вiрусної частки (близько 800 для ВТМ). Тобто в цьому випадку зсув ППР може залежати вiд параметрiв шарiв вже в горизонтальнiй площинi. Це дає можливiсть встановити концентрацiю вiрусних часток у пробi вiдповiдно до калiбрувальної кривої [11, 12]. 158 ISSN Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2013, 12 Для бiосенсорних дослiджень використовували вищезгаданий препарат ВТМ, специфiчну до нього полiклональну кролячу антисироватку (Iнститут сiльськогосподарської мiкробiологiї НААН України) та бiлок А S. aureus ( Sigma ). Вiрус (100 мкг/мл), бiлок А (50 мкг/мл) i антисироватку (розведення вiд 1 : 25 до 1 : 1600) розчиняли в сольовому фосфатному буферi (PBS) ph 7,4, ГКМ (300 мкг/мл) та KNCS (10 2 М, 7 мкл HCl на 1 мл водного розчину), що використовувався нами для захисту бiлкових молекул вiд денатурацiї та надання поверхнi додаткового негативного заряду [11]. Дослiдження проводили за допомогою сканувального SPR спектрометра BioHelper-01 [12]. Склянi пластинки мм з тонким (40 нм) шаром золота, нанесеним через адгезивний шар хрому (2 нм), фiксували на пiдтримуючiй склянiй призмi за допомогою iмерсiйної рiдини (полiфенiловий ефiр), показник заломлення якої близький до показника заломлення скла. Преiнкубацiю компонентiв дослiджуваної сумiшi здiйснювали при кiмнатнiй температурi. Для виявлення впливу ГКМ на подальшу взаємодiю вiрусних часток з антитiлами вiрус iнкубували з полiсахаридом протягом 30 хв, пiсля чого до сумiшi додавали антитiла й iнкубували ще 30 хв. У контрольних варiантах дослiду для дотримання вiдповiдного спiввiдношення мiж компонентами реакцiйної сумiшi замiсть полiсахариду додавали воду. Час iнкубацiї цiєї сумiшi становив також 30 хв. Вимiри здiйснювали в проточному режимi. Швидкiсть протоку становила 50 мкл/хв. Для видалення органiчних забруднень поверхню чiпа обробляли сумiшшю HCl/H 2 O 2 /H 2 O (40 мкл НСl, 40 мкл Н 2 О 2, 200 мкл Н 2 О, спiввiдношення компонентiв 15/15/70). Пiсля ретельного промивання водою наносили розчин KNCS, який потiм змивали, пiсля чого наносили буферний розчин для подальшого нормування отриманих результатiв. Вiдтак на поверхню сенсора наносили розчин бiлка А, а пiсля нього дослiджувану сумiш антитiл i вiрусу за наявностi (дослiд) або вiдсутностi (контроль) полiсахариду. Пiсля iммобiлiзацiї комплексу i промивання поверхнi PBS її обробляли глiциновим буфером (ph 2,2), який руйнує зв язки антигену та антитiл. Центрифугування в градiєнтi густини сахарози. Для вивчення взаємодiї ВТМ та ГКМ застосовували метод центрифугування в градiєнтi густини сахарози. Для цього в центрифужних пробiрках формували лiнiйний градiєнт сахарози вiд 15 до 45% та наносили на поверхню розчину препарат ВТМ (6 мг/мл) у сумiшi з ГКМ (2 мг/мл) та без нього i пiддавали високошвидкiсному центрифугуванню при об/хв (центрифуга Bekmann, ротор SW40). Пiсля центрифугування визначали наявнiсть флуоресцiювальних зон в ультрафiолетовому свiтлi та наявнiсть i стан вiрусних часток у зонах та в осадi, що виникли в результатi центрифугування, методом трансмiсивної електронної мiкроскопiї. Електронна мiкроскопiя. З метою вiзуалiзацiї комплексоутворення мiж ВТМ та ГКМ нами було проведено електронно-мiкроскопiчнi дослiдження, що дають можливiсть оцiнити стан вiрусу в суспензiї з полiсахаридом. Дослiдження виконанi на електронному мiкроскопi JEM Для електронної мiкроскопiї використовували мiднi сiточки з формваровою плiвкою-пiдкладкою, якi вносили в краплю дослiджуваного матерiалу, витримували 1,5 хв та проводили негативне контрастування 2% розчином фосфорно-вольфрамової кислоти (ФВК). Результати та обговорення. З огляду на особливостi хiмiчної будови дослiджуваного нами ГКМ, який у своєму складi, поряд з нейтральними моносахаридами манозою та ксилозою, мiстить у бокових ланцюгах глюкуронову кислоту [14], можна було припустити, що наявнiсть анiонних груп у глiкану може сприяти утворенню комплексу його з вiрiонами ВТМ, зокрема з катiонними групами амiнокислот капсидного бiлка. ISSN Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2013, Рис. 1. Пригнiчення iнфекцiйностi ВТМ на рослинах D. stramonium залежно вiд часу iнкубацiї його з ГКМ та фiзiологiчного стану листя. а iнтактнi рослини, б iзольованi листки Для перевiрки цiєї гiпотези нами проведено ряд бiологiчних, фiзичних та фiзико-хiмiчних експериментiв. Спершу необхiдно було встановити, чи знижується iнфекцiйнiсть ВТМ залежно вiд часу iнкубацiї його з полiсахаридом. Для цього суспензiю ВТМ (20 мкг/мл) змiшували з розчином ГКМ i сумiш, нанесену на листя рослини-iндикатора дурману, iнкубували протягом рiзного часу. У нульовий термiн, iнокуляцiя рослин проходила одночасно зi змiшуванням препарату, що виключало реакцiю вiрусу та глiкану поза клiтиною. В iншi термiни, а саме 5, 10, 30 с, 15 та 10 хв, препарати змiшували i реакцiя вiдбувалася на поверхнi листка. В одному дослiдi iнфiкували iнтактнi рослини, в iншому iзольованi листки дурману. Встановлено, що в обох випадках з подовженням часу iнкубацiї вiрусу з глiканом iнактивацiя ВТМ має тенденцiю до зростання, особливо у випадку використання для тестування iнфекцiйностi iзольованих листкiв, хоча найбiльше достовiрне вiдхилення точки вiд наступних точок на прямiй у першому випадку спостерiгається в нульовий час iнкубацiї вiрусу та iнгiбiтора (рис. 1). Останнє може вказувати на те, що реакцiя мiж вiрусом i полiсахаридом проходить досить швидко за 5 30 с, i вже в iншi термiни випробування iнфекцiйностi iнокулюма переважають iншi механiзми його антивiрусної дiї, зокрема ак
Related Search
Similar documents
View more...
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks