Metode standardizate de evaluare.docx

Description
Metode standardizate de evaluare a biocompatibilitatii Standarde de biocompatibilitate: 1. Teste care exploatează reducerea sărurilor de tetrazoliu; Am dorit să comparăm evaluarea viabilității a două linii celulare, osteoblaste umane și celule de osteosarcom uman, cu ajutorul acestor două kituri. Inițial am testat sensibilitatea kitului CCK-8 pe două linii celulare osoase (HOS (ostesarcom uman) și HOB (oste

Please download to get full document.

View again

of 11
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Information
Category:

Documents

Publish on:

Views: 7 | Pages: 11

Extension: DOCX | Download: 0

Share
Transcript
   Metode standardizate de evaluare a biocompatibilitatii Standarde de biocompatibilitate: 1. T este care exploatează reducerea sărurilor de tetrazoliu;    Am dorit să   comparăm evaluarea viabilității a două linii   celulare, osteoblaste umane și celule de osteosarcom uman, cu ajutorul acestor două kituri. Inițial am testat sensibilitatea  kitului CCK-8 pe două linii celulare osoase (HOS (ostesarcom uman) și HOB (osteoblast e umane) descrise în capitolul material și metode, des utilizate pentru testarea biocompatibilității materialelor cu aplicabilitate medicală (în special materialele destinate implanturilor osoase, plăcilor de osteosinteză cu/fără acoperiri speciale).  Rezul tate: Pentru linia celulară tumorală, absorbanța variază linear cu concentrația   numărului de celule până la 5x105   celule per godeu (concentrația maximă testată), fapt datorat  probabil activității metabolice mult mai intense decât pentru celulele normale. Referitor la comparația între fiabilitatea testului MTT și CCK - 8 (deși fac parte din aceeași categorie,   descrisă în introducerea acestui experiment), am realizat o comparație între sensibilitățile   celor două teste atât pe celule tumorale cât și celule norm ale. Influența pH -ului asupra rezultatelor testelor metabolice de viabilitate/proliferare/ citotoxicitate tip MTT. Am decis efectuarea de unui experiment care să ilustreze variațiile în reducerea   sărurilor de tetrazoliu, comparativ pentru materiale polimer  ice neutre și ușor acide și de  asemenea pentr celule cu fenotip normal versus celule cu fenotip tumoral. Rezultate: Așa cum au arătat și alți autori, dar pe celule tumorale, de obicei mai   rezistente la variații de pH, capacitatea celulară de reducere a for  mazanului (celule HepG2  –  carcinom hepatic) dispare la un pH de 5,9, pentru o incubare de 72 ore. Sub pH de 5, capacitatea de reducere a formazanului dispare, atât pentru celulele incubate pentru o durată   redusă la pHul respectiv (sub 5) sau o durată prelungită la 72 de ore. În experimentul efectuat, durata incubării a fost de la 24 la 192 ore. Atât acidifierea mediului prin incubarea prelungită   fără schimbarea mediului cât și aciditatea latentă a polimerului celulozic testat au determinat o  incapacitate de reducere a formazanului pentru ambele tipuri celulare testate. Testul MTT, în ciuda avantajelor determinate de costul redus sau de timpul redus de lucru (în cazul kitului CCK- 8), prezintă inconvenientul unui timp de incubare de 1-4 ore (de obicei incubarea de 1 oră nu prezintă rezultate consistente, iar incubarea prelungită crește toxicitatea compusului   asupra celulelor) și, de asemenea, al dependenței de variațiile de pH. Este așadar important de   precizat, atunci când este cazul, modul de evoluție a pHulu i în mediul de incubare pentru materialul de testat.   2. Teste pe bază de resazurină/resorufină –  testul Cell Titer Blue; Testele bazate pe principiul transformării resazurinei în resorufină sunt similare celor din categoria MTT, implicit sunt teste metabolice. Acest g en de teste aduce ca și avantaj posibilitatea de cuantificare a resorufinei produse, de obicei această cantitate fiind proporțională cu numărul de celule viabile. Cuantificarea re sorufinei se poate face și prin evaluarea absorbanței, dar    această metodă nu este folosită în  mod curent, deoarece evaluare fluorimetrică este mult mai sensibilă.   Evaluarea toxicității testului Cell TiterBlue   Pentru a evidenția acest elemente și în cazul utilizării kit ului Cell Titer Blue, am utilizat pentru testarea unor pelicule de chitosan (normal total bioco mpatibile), două linii celulare (una normală –  HOB, una tumorală –  HOS, protocoalele fiind identice ca pentru testarea cu kiturile MTT și CCK -8). Rezultate: Am observat o diferență de intensitate a flu oresc enței în funcție de mediul de cultură uti lizat și de timpul de incubare.  Astfel, o extensie a timpului de incubare dincolo de 4 ore a determinat efecte toxice evidente asupra celulelor cultivate pe peliculele de chi tosan. Valorile RLU (unități de luminisce nță, proporționale direct cu viabilitatea celulară) au   scăzut după 4 ore de incubare, rămânând semnificative la 6 ore dar suferind o prăbușire bruscă la toate citirile mai mari de 8 ore de incubare. În același timp, viabilitatea celulelor din setul control (cellule HOS netratate cu resazurină) a crescut în timp și valorile RLU au crescut exponențial, corespunzător cu proliferarea celulară.  Efectele toxice ale res azurinei au fost evidențiate și prin observație microscopică în contrast de fază. Morfologia cel ulară se modifică de la 1 la 4 ore de expunere la reactiv, celulele devenind rotunde, semn de suferință celulară   accentuată. Modificările sunt evidente la 24 de ore, majoritatea celulelor adoptând morfologia sferică. Această morfologie corespunde cu indicii   de viabilitate foarte reduși, evidențiați cu ajutorul kitului  ATPGlo. 3. Testul de detectare a producției de ATP (test metabolic)   Testele de determinare a proliferării/viabilității celulare care exploatează activitatea luciferazei sunt din ce în ce mai răspândite și utilizate și în teste de screening. ATP este un marker extrem de util în aprecierea viabilității celulare. Acest sistem  de testare este foarte avantajos deoarece este omogen, bazându-se pe o reducere a numărului de manevre aplicat plăcii de cultură în care se realizează testul de viabilitate. Un alt av antaj al utilizării testelor pe bază de detectare a ATP prin chemiluminiscență este repreze ntat de sensibilitatea mult mai mare decât a testelor pe bază de tetrazoliu sau resazurină. Am te stat comparativ viabilitatea cu kiturile avute la dispoziție pentru două linii celulare   (HOB și HOS, descrise mai sus, proliferate și  însămânțate după protocoalele descrise pe larg la   materiale și metode) și pentru cele două tipuri de pelicule utilizate în comparațiile testelor pe bază de săruri de tetrazoliu.  Rezultate:  Factori care influențează rezultatele testului pe baza detectării ATP  - temperatura: O etapă de congelare/decongelare nu afectează consistent rezultatele testului. Ulterior însă, de la 2 la 4 recongelări, compusul recon stituit pierde din fiabilitatea răspunsului și rezultatele sunt alterate. Așadar, atunci când nu se lucrează detectări de viabilitate la scară largă și care ar impune utilizarea întregului volum reconstituit de 10mL reactiv Cell Titer Glo, este utilă și accesibilă aliquotarea acestu i reactiv în vederea utilizării raționale pentru experimente la scară redusă.  - compuși chimici care pot rezulta din degradarea parțială a biomaterialului de studiu (în special micro/nanoparticule, hidrogeluri, scaffolduri); orice compus chimic care influențează sau realizează depleția  ATP poate modifica rezultatele acestui test. Am observat, pentru concentrații de ATP între 1nM -10mM o reducere semni ficativă a luminiscenței pentru mediul cu roșu fenol și glucoză. Sensibilitatea maximală a fost notată pentru mediul de cultură fără roșu fenol și fără glucoză, pentru concentrații de ATP între 10nm-10µM. La concentrații ale ATP peste 100µM, rezultatele au fost uniforme. Având  în vedere că în intervalele de studiu  î  n care modificările sensibilității testului sunt semnificative se încadrează marea majoritate a probelor biologice, în funcție de sensibilitatea de  care avem nevoie în realizarea testului de biocompatibilitate, vom folosi mediul adecvat experimentului. - tipul de placă utilizat la citirea reacției luminiscente. Pentru citirea rezultatelo r la testul Cell Titer Glo, având în vedere realizarea lizei celulare, din volumele de lizat din godeurile de lucru se preiau 40µL care sunt plasați în godeurile unei plăci   de cultură cu 384 godeuri, cu pereți opaci, albi și fundul opac, producător Greiner. Spațierea godeurilor de citire este singura soluție pentru evitarea fenomenului de cross -talk. S oluția este facilă din punct de vedere al designului experimental, dar est e un coșmar din pun ct de vedere practic, pentru că pipetările se realizează manual pentru a respecta spațierea înt re godeuri. Din acest motiv, nu se poate utiliza o pipeta multicanal în acest caz. Teste de evaluare a integrității membranare includ dar nu se limitează la:  - testul de excludere cu albastru tripan; - testul de includere a iodurii de propidiu - testul cu roșu neutru  - testul de evaluare a pierderii de LDH - testul cu SytoxGreen Explorarea citotoxicității biomaterialelor cu aplicații m edicale prin teste timecourse versus teste end-point Sondele fluorescente tip CellTracker sunt utile în evalu area motilității și localizării celulare la suprafața sau în volumul unui biomaterial. Probele  CellTracker sunt non- toxice și disponibile într-o gamă largă de fluorofori care pot fi alese în funcție de echipamentul de citire disponibil (combinație laseri/filtre). Prin proprietățile l or chimice, aceste probe permit co- localizare cu anticorpi și alte probe de investigare a comportamentului celular (exemplu  –  alte sonde fluorescente pentru componente subcelulare). Sondele CellTracker sunt excelente pentru monitorizarea proliferării celulare, migrării, fenomenelor chemotaxice și  invazivității celulare. Sondele pot traversa membranele biologice cu ușurință , ceea ce le face incorporabile  în celulele vii, fără a afecta viabilitatea sau expresia fenotipică a acestora (citare articol celltracker fluor probes). Deoarece structura chimică a sonde lor presupune transformarea lor  în produși care nu mai pot traver  sa membranele intacte, aceștia rămân localizați intracelular.   Testele de evaluare a cantității de ADN   Conținutul în acizi nucleici al unui volum de solvit în care se regăsesc celule (lizate) este un indicator fidel al numărului de celule din respec tivul volum. Mai multe teste de proliferare speculează această proprietate; din variantele cunoscute, cităm aici testul CyQuant, descris la material și metode și utilizat în prezentul material de studiu și testul PicoGreen. Pentru evaluarea modului în care celulele depuse pe pelicule polimerice în plăci de polistiren clare cu 96 godeuri (Corning) proliferează și se dezvoltă, am testat 4 linii celulare și anume  –  fibroblaste dermice umane (NDHF), celule de osteosarcom uman (HOS), cellule osteoblastice normale (HOB) și celule epiteliale MCF10A. Metodele de cult ivare, proliferare și detașare pentru pasaje sunt descrise la capitolul materiale și metode. În prezentul experiment, numărul de celule a p ornit de la 3x104 pentru ziua 0. Ulterior, am apreciat valorile de multiplicare a cantității de ADN pentru fiecare godeu.   Aplicarea testului Cy Quant NF pentru cele 4 linii celulare a permis analiza în timp real a datelor pentru cele 8 zile ale experimentului. La finele aces tuia, am interpretat și corelat datele obținute pentru viabilitatea ce lulară pe pelicule de chitosan. Pentru a compara și corela testele metabolice de aprec iere a viabilității celulare cu testele de evaluare a cantității de ADN în acelaș i scop, a m aplicat, pe aceleași pelicule polimerice folosite la testul Cy Quant (pelicule de chitosan) și testele MTT și Cell  Titer Blue. Fig. 1. Profilul de intensitate medie a fluorescenței pentru 3 tipuri de sonde fluroescente în comparație cu profilul similar al Sytox Green, pentru un experiment de cultivare a celulelor HOS pe pelicule polimerice PPVA colagen pentru durate  variabile de incubare (1-8 zile).
Related Search
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks
SAVE OUR EARTH

We need your sign to support Project to invent "SMART AND CONTROLLABLE REFLECTIVE BALLOONS" to cover the Sun and Save Our Earth.

More details...

Sign Now!

We are very appreciated for your Prompt Action!

x